内质网葡萄糖苷酶Ⅱβ亚基OSGAS2调控水稻细胞自噬及细胞程序性死亡的功能研究
OsGAS2,即葡萄糖苷酶Ⅱ的β亚基(Glucosidase 2 beta subunit),可与葡萄糖苷酶Ⅱ的α亚基(Glucosidase 2 Alpha subunit,GAS1)相互作用,剪切新合成糖蛋白的N端α-1,3葡萄糖,产生由钙联蛋白和钙网蛋白识别的单葡糖核心寡糖,钙联蛋白和钙网蛋白是内质网中的伴侣蛋白,对蛋白质的成熟至关重要.在本实验室前期研究中发现水稻OsGAS2是细胞程序性死亡的相关基因.本研究以日本晴水稻为材料,分析GAS2与内质网胁迫(ER stress)介导的PCD之间的关系.采用PEG转化法将带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的OsGAS2转入水稻原生质体中,观察绿色荧光与内质网染料完全重合,证明OsGAS2定位在内质网上.用内质网应激诱导剂DTT处理水稻悬浮细胞后,qRT-PCR分析证明,OsGAS2表达量下调.分别对水稻悬浮细胞进行热激,水稻幼苗进行进行低温、高盐和干旱逆境胁迫后,OsGAS2表达量也下调.据此推测OsGAS2蛋白与ER stress密切相关.使用LH-FAD2-1390水稻RNA干扰载体,利用农杆菌侵染水稻愈伤组织,建立水稻RNAi-OsGAS2悬浮细胞系.用DTT处理野生型和RNAi-OsGAS2悬浮细胞原生质体后,RNAi-OsGAS2原生质体细胞质内Ca2+浓度较野生型有明显提升.对DTT处理过的野生型和RNAi-OsGAS2悬浮细胞原生质体进行LysoTracker Red DND-99标记,RNAi-OsGAS2原生质体胞质内自噬溶酶体数量较野生型明显增多,透射电镜观察进一步验证了这一现象.上述结果证明OsGAS2是自噬的负调控因子,ER stress诱导OsGAS2表达水平下调,导致Ca2+浓度上升,进而引发细胞自噬.OsGAS2是在水稻类Caspase-3蛋白酶的纯化过程中鉴定出来的,表明OsGAS2跟Caspase-3蛋白酶的活性密切相关,为了判断OsGAS2是否会被Caspase-3蛋白酶切割,我们设计了 OsGAS2的Caspase-3蛋白酶体外切割实验.将OsGAS2进行原核表达和纯化,对纯化后的OsGAS2蛋白进行体外caspase-3蛋白酶切割,结果显示OsGAS2可以被caspase-3切割,产生分子量不同的4条片段.对切割后的片段进行western blot检测,进一步证明OsGAS2是Caspase-3蛋白酶的底物.根据上述结果,将OsGAS2可能存在的五条酶切片段进行亚细胞定位,结果表明,缺少C端内质网驻留信号的片段P1-P3定位在细胞质,含有C端内质网驻留信号的片段P4和P5定位在内质网.为了探究P1-P5片段与PCD的关系,本研究设计了 P1-P5体内诱导表达实验.构建地塞米松(DEX)诱导的双元表达载体pTA7002-P1-P5,并瞬时转化水稻叶肉细胞原生质体,诱导P1-P5在细胞质中表达,对上述五个片段分别诱导表达后的原生质体进行LysoTrackerRed DND-99标记,均没有发现自噬溶酶体,表明OsGAS2降解片段失去了调节细胞自噬的功能;对诱导表达的原生质体进行热激处理,并恢复培养6 h,随后检测其类Caspase-3蛋白酶的活性,结果显示P5组的DEVDase活性较P1-P4组和对照组有显著提高.提示OsGAS2蛋白被caspase-3蛋白酶酶切后片段具有放大类caspase-3蛋白酶活性的功能.综上所述,本研究的结果表明OsGAS2在植物细胞自噬和细胞程序性死亡之间发挥重要的转换器作用:当中度内质网胁迫发生时,OsGAS2的表达水平下调,通过提升细胞质Ca2+水平诱导细胞自噬;而严重的内质网胁迫可激活类caspase-3蛋白酶活性,切割OsGAS2,其水解片段P5反馈放大类caspase-3活性,促进PCD的发生.
- 作者：
- 崔静
- 学位授予单位：
- 南京农业大学
- 专业名称：
- 生物化学与分子生物学
- 授予学位：
- 博士
- 学位年度：
- 2015年
- 导师姓名：
- 张炜
- 中图分类号：
- S511；Q943.2
- 关键词：
- 水稻；OsGAS2；细胞程序性死亡；内质网胁迫；细胞自噬；类caspase-3蛋白酶
- Oryza sativa； GAS2； programmed cell death； ER Stress； Autophagy； caspase-3 like protease