深海微生物的多样性及其功能酶研究
海洋占据地球约71%表面积,是地球上最大的生物栖息系统.由于它复杂多变的环境特点,蕴藏着巨大的微生物资源.尤其是深海区域的微生物,可耐受环境中特有的高盐、高压、低温(或局部高温)、寡营养、低光照等极端条件,形成了多种多样的酶系统来适应自身生存的恶劣环境,因此开发深海微生物丰富的酶基因资源是实现海洋生物资源高值化利用的有效途径之一.其中,存在于海洋微生物中的普鲁兰酶(pullulanase,EC3.2.1.1/41)是一类淀粉脱支酶,它能够专一性水解支链淀粉中的α-1,6糖苷键,使支链淀粉变成直链淀粉,这种特性决定了它在淀粉加工相关工业中的广泛应用.然而如今我国所使用的商品普鲁兰酶几乎全部依赖于进口,价格昂贵,提高了相关企业的生产成本,限制了我国相关产业的快速发展.因此我们从深海微生物中寻找高产普鲁兰酶的菌株、开发其普鲁兰酶基因资源,以期为将来我国的普鲁兰酶商业化生产奠定良好的实验基础.本文以"可培养微生物分离鉴定-功能酶筛选-普鲁兰酶基因克隆表达"为研究线索,从以下几方面对深海微生物的多样性及功能酶展开研究:(1)以西北太平洋与中印度洋多个站位不同深度的海水为研究对象,分离并鉴定了1 225株细菌,对这些可培养细菌进行了统计分析.结果表明所获取的这些菌株分属于变形菌门、放线菌门、拟杆菌门以及厚壁菌门四个类群中,其中尤以α-变形菌纲与γ-变形菌纲的菌株数目最多.(2)将分离得到的这1 225株细菌进行了7种常见功能酶(包括淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、壳聚糖酶、褐藻胶裂解酶以及卡拉胶酶)活性的筛选,通过平板透明圈法对这些菌株所具有的功能酶活性进行了初步的评价.结果显示具有淀粉酶活性的菌株有220株;具有蛋白酶活性的有231株;具有脂肪酶活性的仅有16株;具有壳聚糖酶活性的有302株;具有褐藻胶裂解酶活性的有297株;具有κ-卡拉胶酶活性的有289株;未筛选得到具有纤维素酶活性的菌株.(3)将筛选得到的具有淀粉酶活性的220株菌株再次进行产普鲁兰酶活性的筛选,经过固体培养基透明圈法初筛与液体培养基DNS试剂法复筛,得到了一株产胞外普鲁兰酶活力较强的野生菌株Alteromonas sp.Y-389.随后对其发酵使用的培养基成分与培养条件进行优化设计,以期探究该野生菌株的最大产酶能力.经单因素实验分析,结果显示其产酶活力达到了7.69 U/m L,证明该野生菌株具备高产胞外普鲁兰酶的能力,具有较大的后续研究价值.(4)运用分子生物学手段,对野生菌株Alteromonas sp.Y-389的普鲁兰酶编码基因pulA进行克隆,随后对其测序并进行生物信息学分析.结果表明该普鲁兰酶基因pulA的ORF全长是4 347 bp,编码了一个含有1 449个氨基酸的蛋白质PulA;经过系统发育分析,该蛋白质PulA与多个来源于Alteromonas sp.的普鲁兰酶具有较近的亲缘关系;进一步的生物信息学分析显示,该蛋白质PulA理论分子量为158.68 kDa,理论等电点为4.15,属于PulA超家族.(5)以质粒pET-28a(+)为载体插入普鲁兰酶基因pulA片段,构建了基因工程菌.在IPTG的诱导下,于重组菌株的胞浆中成功地表达出了可溶性的目标普鲁兰酶PulA,随后对其进行了分离纯化与酶学性质的表征.结果显示该酶的比活力为54.53 U/mg,最适pH和温度分别为6.0和35℃,Mn2+对该酶有明显的激活作用而Cu2+、Zn2+与Fe2+显著地抑制其酶活性,该酶属于Ⅰ型普鲁兰酶,其Km和Vmax分别为14.97 g/L和0.36 g/(L·min),该研究为今后普鲁兰酶的工业化生产奠定了良好的实验基础.
- 作者：
- 王淑艳
- 学位授予单位：
- 国家海洋局第一海洋研究所
- 专业名称：
- 海洋生物学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2018年
- 导师姓名：
- 陈颢
- 中图分类号：
- Q93
- 关键词：
- 深海微生物；功能酶筛选；普鲁兰酶；发酵条件优化；克隆与表达；酶学性质
- deep-sea microbes； functional-enzyme screening； pullulanase； optimization of fermentation conditions； cloning and expression； enzymatic properties