表达猪瘟E2基因重组伪狂犬病毒的构建及其部分生物学特性分析
Construction of Recombinant Pseudorabies Virus(PRV) Expressing E2 Gene of Classical SwineFever Virus (CSFV) and Analysis of Its PartialBiological Characteristics
猪瘟(Classical swine fever,CSF)作为世界动物卫生组织(OIE)规定必须报告的疫病,对世界养猪业造成极大危害,是养猪业防控的重要传染病.因此,涉及猪瘟防控用疫苗的研究非常活跃.E2囊膜糖蛋白作为CSFV的主要结构蛋白,它介导病毒的感染,诱导机体产生中和抗体,是重要的保护性抗原蛋白.因此,猪瘟E2蛋白是研制新型活载体疫苗、亚单位疫苗的重要靶蛋白.已有研究表明,杆状病毒表达E2蛋白亚单位灭活疫苗、重组猪瘟E2基因的腺病毒活载体疫苗、重组猪瘟E2基因的伪狂犬病毒活疫苗均表现出良好的免疫效果.伪狂犬病(Pseudorabies,PR或Aujeszky's disease,AD)是一种由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的急性传染病,可引起仔猪的高死亡率,母猪的繁殖障碍,育肥猪的神经及呼吸系统症状,公猪的种用性能降低或丧失等,对养猪业危害极大.PRV基因组为线性双链DNA,大小约145 kb,可编码70100种病毒蛋白,其中含有大量与病毒增殖无关并可插入外源基因的非必需区域,是优良的活病毒载体.PRV重组活疫苗对由与载体遗传关系相近的PRV强毒引起的PR具有良好的免疫效果.研究以本实验室构建的TK、gI、gE、US9、部分gN基因缺失的绿色荧光标记猪伪狂犬病毒rPRV-BE为亲本株,成功构建了转移质粒p MD-US6-US7-E2-US2,用脂质体转染法将亲本株rPRV-BE和转移质粒pMD-US6-US7-E2-US2共转染PK15细胞,经过多轮蚀斑筛选、纯化,获得含有猪瘟病毒(CSFV C株)主要免疫原性基因E2的重组伪狂犬病毒rPRV-CSFV PE2SC.经PCR、基因测序、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定证实构建正确,并能成功表达E2蛋白.同时,对重组病毒在PK15细胞中的遗传稳定性、增殖特性等进行了研究,结果显示第5、10、15、20代重组病毒经PCR均能扩增出与原代重组病毒相同大小的约为3469 bp含猪瘟病毒E2基因的重组片段;第20代重组病毒感染细胞孔中出现明显的针对E2蛋白的荧光,表明重组病毒在体外连续传20代后仍能稳定遗传.一步生长曲线测定结果表明,与野毒PRV(SX株)、亲本毒rPRV-BE相比,重组病毒rPRV-CSFV PE2SC前期增殖速度较快,病毒滴度到达峰值的时间早,峰值病毒滴度低于野毒,与亲本毒相当,最高病毒滴度依次为重组病毒106.7TCID50/mL、野毒108.0TCID50/mL、亲本毒107.0TCID50/mL,结果显示构建的重组病毒具有良好的遗传稳定性及体外复制能力.在健康小鼠、家兔和易感仔猪上进行安全性试验,分别以104.0、105.0、106.0、107.0TCID50/只的剂量接种小鼠和家兔,以106.0、107.0TCID50/只的剂量接种易感仔猪,对照组接种同等剂量的生理盐水,接种后观察14 d,在观察期内均未出现不良反应,说明重组病毒rPRV-CSFV PE2SC毒力弱,具有良好的安全性.该实验结果为进一步对其免疫效果的评价以及PRV基因缺失重组疫苗的研制奠定了基础.
- 作者：
- 韩爽
- 学位授予单位：
- 中国兽医药品监察所
- 专业名称：
- 预防兽医学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2018年
- 导师姓名：
- 夏业才
- 中图分类号：
- S852.65
- 关键词：
- 伪狂犬病毒；猪瘟病毒；基因缺失；同源重组；生物学特性
- Pseudorabies virus (PRV)； Classical swine fever virus (CSFV)； Gene deletion； Homologous recombination； Biological characteristics