海洋产油微生物筛选及酰基载体蛋白基因克隆
微生物油脂是指细菌、酵母、霉菌和藻类等微生物在适当的条件下,将碳水化合物转化并储存在细胞内的油脂.海洋微生物在极端非标准条件下可以产生许多包括脂肪酸、抗肿瘤、抗菌、不饱和脂肪酸等生物活性物质.酰基载体蛋白作为一类非常保守的转运蛋白,在脂肪酸代谢中可作为酰基供体,是不可或缺的辅因子.研究酰基载体蛋白的结构和功能,为指导脂肪酸合成途径的应用和改造提供依据.通过苏丹黑B染色和酸热法从海洋淤泥及岩石附着藻类中筛选得到一株海洋产油菌T-1.经鉴定,命名为海洋季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii T-1.设计正交试验对酸热法提取油脂条件进行优化,最优条件为每0.5 g干菌体需4 mol/L盐酸体积10 mL,酸热时间10 min,萃取剂氯仿-甲醇(2:1)体积25 mL,0.15%NaCl溶液体积10 mL,最优条件下油脂得率为40.12%.海洋季也蒙毕赤酵母T-1基因组DNA为模板,扩增酰基载体蛋白基因,获得384 bp的目的片段.生物信息学分析显示,其具有完整的开放阅读框,编码127个氨基酸,含有磷酸泛酰巯基乙胺结合位点,为非分泌型的亲水性蛋白,不存在信号肽,存在9个潜在的磷酸化位点,二级结构和三级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主.构建表达载体pET21a-mgACP,并成功转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞.用IPTG诱导目的基因表达,生长动力学试验结果表明IPTG最佳浓度为0.1 mmol/L,并以此浓度进行诱导基因表达目的蛋白,用SDS-PAGE进行分析,表达的融合蛋白分子量为22.0 KDa左右.
- 作者：
- 陶永佳
- 学位授予单位：
- 大连工业大学
- 专业名称：
- 生物学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2017年
- 导师姓名：
- 薛永常
- 中图分类号：
- Q93；Q78
- 关键词：
- 海洋季也蒙毕赤酵母；酸热法；酰基载体蛋白；生物信息学
- Meyer ozyma guilliermondii； acid-heating extraction； acyl carrier protein； Bio informatics