中国小麦花叶病毒(CWMV)vsiRNA-20调控寄主基因表达的研究
Regulation of Host Gene Expression by vsiRNA-20 Derived from Chinese Wheat Mosaic Virus (CWMV)
中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)是我国冬小麦上鉴定的一种新的麦类土传病毒,属于真菌传杆状病毒属.该病毒由根部专性寄生的禾谷多黏菌(Polymyxa graminis)传播.自20世纪90年代在山东首次发现以来,关于CWMV基因组结构和功能的研究有明显的进展.在本实验室前期研究中,通过small RNA测序发现大量CWMV vsiRNAs,其大小主要为21-22nt,来源于基因组的5'端.这些vsiRNAs被招募到AGO蛋白上形成沉默复合体(RISC),从而干扰寄主植物基因的表达.本研究利用各种分子生物学的方法进一步研究CWMV vsi RNAs的调控功能.首先,通过qPCR分析表明感染CWMV后vsiRNA-1~5,-7~13和-15~22均能高丰度表达,同时Northern-blotting能特异性检测到vsiRNA-1,-3,-5,-12,-13和-20.结合本实验室前期的降解组测序,利用CleaveLand技术预测到vsiRNA的三个靶基因.进一步通过qPCR分析表明在感染CWMV后vsiRNA-20的积累量急剧上升,在20-25天达到最高峰,此后趋于相对稳定;而其靶基因TaVP的表达在15-30天内呈现持续下降的趋势.因此,vsiRNA-20与其靶基因TaVP的表达模式存在负相关性.我们克隆获得TaVP全长基因,序列分析表明TaVP具有高度保守的PPi结合位点;通过对NCBI数据库中不同物种间氨基酸序列分析其同源性为75.19-89.29%,然后绘制系统发育树发现TaVP与OsVP最相近.然后,利用5'RACE分析发现vsiRNA-20的作用靶点位于TaVP 3'-UTR区域,表明vsiRNA-20能够调控TaVP的表达.为了进一步验证其关系,通过构建vsiRNA-20和融合TaVP 3'-UTR区域的GFP双元表达载体浸润本氏烟,结果显示vsiRNA-20能够特异下调TaVP基因的表达.为进一步研究vsiRNA-20对TaVP的调控,我们分别构建VIGS载体沉默NbAVP和TaAVP基因,结果显示均会增加CWMV的积累量并加重病株花叶症状的形成.综上所述,CWMV vsiRNA通过下调其靶基因转录水平的表达,从而影响症状和病毒的致病性.本研究为CWMV与寄主之间的互作提供新的认识.
- 作者：
- 吴讷
- 学位授予单位：
- 浙江农林大学
- 专业名称：
- 园艺(专业学位)
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2018年
- 导师姓名：
- 陈剑平；张恒木；羊健
- 中图分类号：
- S432.41
- 关键词：
- 中国小麦花叶病毒；实时定量PCR；vsiRNA；TaVP
- Chinese wheat mosaic virus; qPCR; vsiRNA; TaVP;