水稻硝酸盐转运体伴侣蛋白基因OsNAR2.1响应硝酸盐及其与OsNRT2成员互作的机制研究
The Responses of Nitrate Transport Accessory Protein Gene OsNAR2.1 to Nitrate and Its Interaction with OsNRT2 Members

水稻(Oryza sativa L.)是世界上超过半数人口的主食,是重要的粮食作物之一,作为单子叶植物其在植物生物学研究领域中是重要的模式作物.氮素(N)是调控植物生长发育的主要营养因子,而土壤中的铵态氮(NH4+)和硝态氮(NO3-)是植物吸收氮源的主要形式.在淹水环境下,土壤中主要以NH4+形式存在,但是由于水稻根部泌氧功能,在干湿交替时硝化细菌可以通过硝化作用将NH4+转化为NO3-,因此水稻可以同时吸收NH4+和NO3-,并且在潮湿土壤环境下水稻根系吸收的NO3-占总氮含量的20%-40%.植物能够响应土壤中高低浓度的NO3-信号,通过两个转运系统:高亲和硝酸盐转运系统(HATS)和低亲和硝酸盐转运系统(LATS)来参与NO3-的吸收和运输.由于水稻长期生长在淹水环境下,土壤中NO3-的浓度很低,因此水稻主要由高亲和硝酸盐转运系统来吸收利用NO3-.目前人们通过分子生物学手段研究了众多硝态氮运输系统的基因,在水稻中研究发现由NAR2s和NRT2s组成的双组份系统能够共同参与NO3-的吸收.本文以水稻硝酸盐转运体伴侣蛋白基因OsNAR2.1及其互作蛋白OsNRT2成员为研究对象.首先构建不同突变的OsNAR2.1启动子融合GUS报告基因的水稻转基因材料,以进一步寻找NO3-响应的调控元件;通过亚细胞定位、Western Blot杂交分析、酵母双杂交、蛙卵15N-NO3-吸收、BIFC荧光互补等实验分析OsNAR2.1与OsNRT2成员在蛋白水平上的互作;并创建OsNAR2.1和OsNRT2成员的超表达材料,从而了解高亲和硝酸盐运输蛋白的双组份系统对NO3-的吸收以及其它可能互作的生理机制.主要研究结果如下:1.构建不同长度和不同突变的OsNAR2.1基因启动子融合GUS报告基因的转基因材料,观察转基因水稻在NH4+、NO3-处理下的GUS表达特征.发现-129bp到-1bp区域存在NO3-响应的调控元件.-192bp到-129bp中保守的20bp是作为转录增强子来调控水稻OsNAR2.1的转录,但是它不能单独起作用,说明OsNAR2.1启动子需要20bp和129bp至少有两个关键区域来参与响应NO3-的信号.2.通过酵母双杂交和蛙卵异源表达15N的吸收实验,发现两个蛋白之间是相互作用的,双荧光互补实验(YFP)/BiFC发现OsNAR2.1与OsNRT2.3a是共定位于细胞质膜(PM)上的.Western Blot和GFP融合OsNAR2.1蛋白的亚细胞定位发现,OsNAR2.1蛋白定位于PM和细胞质中.然而点突变氦基酸R100或D109之后,OsNAR2.1与OsNRT2.3a在蛙卵中不再共吸收硝酸盐,两者在细胞质膜上的定位也发生了改变.我们的实验结果证明,R100或D109是OsNAR2.1与OsNRT2.3a蛋白发生互作的关键氨基酸,并且它们是共定位于PM上而不是细胞质中来完成N03-的共吸收和转运.3.通过水稻转基因获得OsNAR2.1单独超表达、OsNRT2.1/2.2单独超表达、OsNRT2.3a单独超表达、OsNRT2.1/2.2与OsNAR2.1共超表达、OsNRT2.3a与OsNAR2.1共超表达的转基因水稻,通过RT-PCR、Southern blot和TAIL-PCR鉴定筛选稳定遗传的转基因株系.转基因田间表型和不同形态氮素处理下的实验表明:与野生型相比,单独超表达OsNAR2.1后,能够增强OsNRT2.3a、OsNRT2.1/2.2的表达,而且能够促进对N03-的吸收和水稻的生长.单独超表达OsNRT2.3a、OsNRT2.1/2.2的材料并没有显著地田间表型差异,也没有引起地上部和地下部NO3-的浓度差异,而OsNRT2.1/2.2与OsNAR2.1共超表达、OsNRT2.3a与OsNAR2.1共超表达的转基因水稻,不仅改变了OsNRT2s与OsNAR2s的表达量,并且地上部和地下部的总氮浓度和NO3-浓度都有不同程度的改变,田间表型与野生型相比也出现了显著的差异.综上所述,水稻高亲和硝酸盐转运体伴侣蛋白基因OsNAR2.1可以响应环境中的NO3-信号,但是NRT成员基因启动子却没有N03-响应的这些调控因子,这说明两个家族由不同的上游转录因子调控,或者OsNAR2.1作为辅助蛋白基因首先感应到NO3-信号,进而将这种信号传递给NRT2成员基因,从而调控NO3-的吸收利用.并且OsNAR2.1蛋白保守的氨基酸R100或者D109是OsNAR2.1与OsNRT2成员发生蛋白互作的关键氨基酸,它们的突变影响了两个家族共定位于PM共吸收NO3-的特性.转基因生理功能分析表明,OsNAR2.1作为NRT2成员的伴侣蛋白基因,可能是激活OsNRT2.1/OsNRT2.2和OsNRT2.3a行使功能的关键基因,OsNAR2.1直接或者间接调控OsNRT2.3a、OsNRT2.1/2.2这三个基因的表达,进而影响水稻对NO3-的吸收运输.