LINE-1-ORF2抗体制备及其在肾母细胞瘤研究中的初步应用
背景与目的肾母细胞瘤(Wilms tumor,WT)是最常见的儿童原发性泌尿系统恶性肿瘤,占15岁以下儿童恶性肿瘤的6%~7%,其中约75%散发于5岁以下儿童,伴先天畸形患者发病年龄常在1岁以前,平均发病年龄约为3.5岁.近年来,随着基于个体特异性的手术、化疗及放疗三者相互结合的综合治疗方案的开展,几乎85%的肾母细胞瘤的患儿可被治愈,然而个体特异的长期治疗方案同时也伴随了较高的预后风险,少数患儿由于复发、转移或对化疗药物的不敏感等多种因素而导致死亡.而肾母细胞瘤的发病机制纷繁复杂,众多遗传学及表观遗传学因素参与其中,且缺乏靶向治疗药物,给早期诊断及治疗带来了极大的困难.越来越多的证据表明,占人类基因组17%并具有潜在自主转座活性的LINE-1是影响人类基因组稳定性的重要因素.在人类肿瘤细胞中会发生LINE-1的表达和转座,表明LINE-1的转座与癌症有着密切的关系.LINE-1在肿瘤中普遍低甲基化及L1-ORF1、L1-ORF2蛋白能在多种肿瘤细胞中特征性表达的现象,均表明LINE-1具有成为肿瘤生物学标志物的潜力.LINE-1低甲基化现象已能在肾母细胞瘤中检测到,但L1-ORF2的表达与肾母细胞瘤的发病机制间的联系目前尚无明确研究.鉴于目前市场上没有同时具备较好特异性和敏感性的L1-ORF2抗体出售,我们计划制备L1-ORF2抗体来检测L1-ORF2在肾母细胞瘤中的表达情况,从而为肾母细胞瘤发病机制的研究提供新的思路,进而有助于肾母细胞瘤的早期诊断及治疗.方法:本实验通过基因工程表达方法制备L1-ORF2蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,检测其效价及特异性,并应用该抗体对肾母细胞瘤细胞系进行免疫荧光检测及过表达研究.结果1.构建重组质粒p ET28a-L1-ORF2-EN,表达并纯化L1-ORF2-EN融合蛋白.2.将纯化浓缩的L1-ORF2-EN融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗血清,经间接ELISA、Western Blot及免疫组化检测证明其具有良好的效价及特异性,能应用于肿瘤的初步研究.3.以L1-ORF2抗血清作为一抗对WT?CLS1(肾母细胞瘤细胞系)细胞进行免疫荧光检测,显示了WT?CLS1细胞核及胞浆中L1-ORF2的分布.4.构建真核重组质粒p EGFP-N3-L1-ORF2,并瞬时转染WT?CLS1细胞.用制备的L1-ORF2抗血清对过表达L1-ORF2蛋白的WT?CLS1细胞裂解物进行Western Blot,能检测到大小约149KDa的特异条带,而空质粒转染和未转染WT?CLS1细胞条带较弱,表明转染后能明显提高L1-ORF2的表达量.结论我们采取基因工程表达方法制备了L1-ORF2蛋白、进而免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,且ELISA、WB及免疫组化等方法证实制备的多抗具有良好的效价及特异性,能够应用于肿瘤的初步研究.我们应用制备的多克隆抗体对肾母细胞瘤细胞系进行了免疫荧光检测及过表达研究,初步探讨了肾母细胞瘤细胞中L1-ORF2的表达情况,为后期对肾母细胞瘤细胞在不同药物作用条件下L1-ORF2蛋白水平进行检测等研究作准备,为探索肾母细胞瘤的发生发展机制、个体化综合治疗方案的选择及精准治疗提供参考依据.
- 作者：
- 曾蕊
- 学位授予单位：
- 首都儿科研究所
- 专业名称：
- 儿科学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2017年
- 导师姓名：
- 吴建新
- 中图分类号：
- R737.11
- 关键词：
- LINE-1-ORF2；多克隆抗体；肾母细胞瘤
- LINE-1-ORF2； PcAb； Wilms tumor