miR-206和氯沙坦对血管钙化的影响研究
第一部分miR-206对高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的影响研究目的:血管钙化是动脉粥样硬化、糖尿病、慢性肾病的主要并发症.其中血管平滑肌细胞(VSMCs)向成骨样细胞分化是血管钙化的中心环节.新近研究发现微小RNA(miRNA)在心血管系统高表达,某些miRNAs参与VSMCs钙化过程.本研究以β-甘油磷酸钠(β-GP)诱导建立VSMCs钙化模型,观察miR-206对VSMCs钙化的影响,并探讨可能的分子机制,为临床治疗血管钙化提供新思路.方法:分离与培养大鼠主动脉VSMCs并进行细胞鉴定.用10 mMβ-GP诱导大鼠主动脉VSMCs,建立细胞钙化模型.采用微量酶标法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,Western blot检测runt相关转录因子2(Runx2)表达,并用茜素红染色检测VSMCs钙化结节量.以miR-206模拟物(miR-206 mimics)及miR-206抑制剂(mi R-206 inhibitor)瞬时转染VSMCs,同时转染阴性对照组,用10 mMβ-GP诱导VSMCs钙化,同样方法检测ALP活性、钙化结节量,用免疫荧光方法检测缝隙连接蛋白43(Cx43)表达情况.结果:在β-GP诱导下,VSMCs中ALP活性增强、Runx2表达增加,经茜素红染色出现明显钙化结节,提示VSMCs向成骨样细胞分化.转染mi R-206mimics的VSMCs,与对照组相比,ALP活性显著降低、钙化结节数量下降且Cx43表达显著降低;转染miR-206 inhibitor的VSMCs,与对照组相比,ALP活性显著增加、钙化结节数量增加且Cx43表达显著升高.结论:β-GP诱导VSMCs钙化,过表达miR-206能抑制VSMCs钙化,Cx43表达下调;而抑制miR-206表达能促进VSMCs钙化,Cx43表达上调.miR-206通过调控Cx43表达来影响VSMCs钙化.第二部分氯沙坦对华法林诱导的大鼠血管钙化的影响研究目的:观察氯沙坦对华法林诱导大鼠主动脉血管钙化的影响,并探讨其可能的作用机制.方法:28只8周龄雄性SD大鼠随机分为4组:对照组(C组)、模型组(M组)、模型+低剂量氯沙坦组(M+L组)、模型+高剂量氯沙坦组(M+H组).给予华法林(15mg/100g/12h)和维生素K1(1.5mg/100g/24h)皮下注射连续2周建立大鼠血管钙化模型.氯沙坦干预组在模型组基础上于造模第2周分别给予低剂量氯沙坦(1mg/100g/24h)和高剂量氯沙坦(2mg/100g/24h)皮下注射,连续7天.造模结束后取各组大鼠主动脉进行HE染色和茜素红染色,观察血管壁形态学变化和钙盐沉积情况.用实时荧光定量PCR检测Cx43、骨形态发生蛋白(BMP2)、Runx2 m RNA的表达,用Western blot检测Cx43、BMP2、Runx2、基质羧谷氨酸蛋白(MGP)的表达.结果:(1)华法林联合维生素K1能成功制备大鼠血管钙化模型.(2)与Control组比较,模型组Cx43 m RNA水平及蛋白水平均升高(P<0.05);与模型组比较,氯沙坦干预组Cx43 m RNA及蛋白水平均降低,且高剂量组降低有统计学意义(P<0.05).(3)与Control组比较,模型组Runx2 m RNA及蛋白水平均显著性升高(P<0.01);与模型组比较,氯沙坦干预组Runx2 m RNA及蛋白水平均降低,且高剂量组降低有统计学意义(P<0.05).(4)与Control组比较,模型组BMP2 m RNA及蛋白水平均显著性升高(P<0.01);与模型组比较,氯沙坦干预组BMP2蛋白水平均降低(P<0.05),且高剂量组降低有显著统计学意义(P<0.01).(5)与Control组比较,模型组MGP蛋白水平显著性降低(P<0.01);与模型组比较,氯沙坦干预组MGP蛋白水平均升高(P<0.05),且高剂量组升高有显著统计学意义(P<0.01).结论:氯沙坦抑制华法林诱导的大鼠主动脉血管钙化,与Cx43、BMP2、Runx2表达下调,MGP表达上调有关.
- 作者：
- 邵娟
- 学位授予单位：
- 湖北科技学院
- 专业名称：
- 药学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2016年
- 导师姓名：
- 李敏才；舒诚荣
- 中图分类号：
- R965
- 关键词：
- miR-206；Cx43；VSMCs；钙化；氯沙坦；血管钙化；BMP2；Runx2；MGP
- miR-206; Cx43; VSMCs; calcification; Losartan; vascular calcification; BMP2; Runx2; MGP;