猪传染性胃肠炎病毒ELISA抗体检测方法的建立及胶体金免疫层析试纸条的研制
Development of ELISA Detection Method for Antibody and Colloidal Gold Immunochromatographic Strip of Transmissible Gastroenteritis Virus
猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一种猪的急性、高度接触性传染病,以腹泻、呕吐、脱水等为主要临床特征,是近年来引起我国及亚洲其他国家腹泻病的主要病原之一,对养殖业造成了严重的经济损失.TGE的快速准确的诊断对于该病的防控十分重要.然而目前我国尚无正式注册的商品化TGE抗原或抗体检测试剂或试剂盒.因此,亟需开展TGEV抗原或抗体检测试剂或试剂盒的研究,以更好地服务我国猪传染性胃肠炎疫情防控.本研究主要开展了以下几个方面的工作:1.TGEV病毒的分离与鉴定将从内蒙古某猪场采集的经胶体金试纸条和RT-PCR鉴定为TGEV阳性的粪便样品,在ST细胞上分离培养后,得到一株能产生明显细胞病变的毒株.经纯净性检测,该毒株无菌生长、无支原体污染及外源病毒污染.特异性检测结果显示:该分离株能被猪传染性胃肠炎病毒特异性阳性血清中和,且能被TGEV FA荧光抗体识别.经对该分离株进行全序列测定并与GenBank登录的13株TGEV毒株进行同源性比较,显示同源性为97.9%~99.9%,与我国TGEV疫苗株华毒株同源性为99.9%.系统进化树表明,该分离毒株与TGEV华毒株强毒株和弱毒株、Miller株、TS株和JS2012株亲缘关系较近.以上结果表明分离到的毒株TGEV,命名为TGEVNMG株.2.TGEV间接ELISA抗体检测方法的建立以浓缩纯化的TGEV灭活病毒作为包被抗原,建立了间接ELISA抗体检测方法.其优化反应条件为:该批抗原最佳包备稀释浓度为1:2560,抗原包被量1.36 μg/孔;最佳包被时间为4℃过夜(约10~16小时);封闭液为5%脱脂牛奶,37℃封闭2h;血清样品最佳稀释度为1:400,37℃作用1h;兔抗猪酶标二抗最佳稀释度为1:20000,37℃作用1h;抗体临界值为S/P≥0.40判为阳性,S/P<0.40判为阴性.进一步试验证实,该方法具有较好的敏感性、特异性、重复性和符合率,显示出较好的应用前景.3.TGEV N融合蛋白的原核表达和鉴定成功构建了 TGEVN基因的原核表达载体pET-28a,经转化感受态细胞Rosetta(DE3)、IPTG诱导表达和SDS-PAGE电泳检测,显示重组大肠杆菌能够有效表达TGEV N重组蛋白,目的蛋白大小为50kDa,且以可溶性蛋白表达形式为主.Western blot结果表明,该重组蛋白能被猪抗TGEV特异性阳性血清识别,具有良好的抗原性.4.TGEV N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定以纯化的重组TGEVN蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠致敏脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG作用下融合,经克隆培养、间接ELISA方法和IFA方法筛选,获得了 3株能稳定分泌抗TGEVN蛋白的抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为MAb-N-10#,MAb-N-17#,MAb-N-18#.生物学鉴定试验表明:3株细胞株抗体类型和亚类均为IgG1,经20代连续继代后细胞培养上清均能与TGEV阳性固定板呈现IFA阳性反应,显示出良好的遗传稳定性.单抗腹水纯度均在90%以上,亲和常数分别为4.3*109,1.22*109,7.52*108,敏感性显示IFA效价均不低于1:1600,且特异性良好,为建立TGEV抗原快速检测试剂盒奠定了物质基础.5.TGEV胶体金免疫层析试纸条的研制应用胶体金免疫层析技术,采用柠檬酸三钠还原法制备20nm的胶体金颗粒,标记单克隆抗体Mab-N-17#后包被于玻璃纤维膜作为金标垫,在硝酸纤维素膜上分别包被羊抗小鼠IgG和单克隆抗体Mab-N-10#株作为质控线和检测线,组装成胶体金检测试纸条.该试纸条具有良好的特异性和敏感性,与RT-PCR检测结果吻合性较好,检测灵敏度约为102.1TCID50/0.1mL,与进口产品的符合率为100%,敏感性优于进口试剂.
- 作者：
- 李嘉琛
- 学位授予单位：
- 中国兽医药品监察所
- 专业名称：
- 预防兽医学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2017年
- 导师姓名：
- 夏业才
- 中图分类号：
- S858.28
- 关键词：
- 猪传染性胃肠炎病毒；ELISA；N蛋白；单克隆抗体；胶体金
- Transmissible gastroenteritis virus; ELISA; N protein; monoclonal antibody; colloidal gold strip;