双酚A调控鸡胚卵母细胞减数分裂的机制研究
双酚A(Bisphenol A,BPA)是环境内分泌干扰物(EDC)的一种,其化学结构和雌激素结构类似,具有弱雌激素的活性.研究证明,BPA能够进入体内,干扰内分泌系统,影响体内的激素代谢,对机体的生殖、发育等都会产生影响.目前,有关BPA的研究主要集中在雄性的生殖毒理和雌性妊娠期暴露的发育毒性的研究,而低剂量的BPA对雌性发育有利方面的研究少之又少.BPA具有和雌激素类似的结构,因此它在体内的作用方式是通过与雌激素受体结合的方式发挥作用.本论文通过研究BPA对鸡胚卵巢中卵母细胞发育的影响来探讨BPA对卵母细胞的减数分裂的作用及机制,为进一步研究卵母细胞减数分裂过程和卵子发生、发育的分子机制,提供理论基础.1.鸡胚卵巢组织体外培养体系的建立以及BPA对卵母细胞减数分裂的作用法国萨索鸡种蛋孵化到E12.5,分别以0,0.1,1,10 ug/mL的BPA处理体外培养的卵巢组织3天,结果表明,10 ug/mL的BPA可以显著提高减数分裂相关基因Stra8,Scp3和和Dmc1的表达(P<0.05).10 ug/mL 的 BPA处理E10.5,E12.5,E15.5和E17.5的卵巢组织后,显著提高了Stra8,Scp3和Dmc1基因在E12.5,E15.5,E17.5和E18.5卵巢中的表达(P<0.05).此外,BPA还可以显著降低卵巢中DNA甲基化转移酶Dnmt1,Dnmt3α,Dnmt3β的表达(P<0.05).2.BPA对体外培养的鸡胚卵巢组织中雌激素受体表达的影响体外培养的E15.5卵巢组织中分别加入E2和雌激素受体抑制剂(ICI182780)然后通过QRT-PCR方法检测雌激素受体(ERα,ERβ,和GPR30)在卵巢中的表达.结果表明BPA可以提高ERβ在卵巢组织中的表达,但对ERα和GPR30的表达无显著影响(P>0.05).因此,推测BPA是通过与ERβ的结合而发挥作用的.而通过Western blot结果表明,BPA能够显著促进ERβ的蛋白的表达.3.BPA注射对鸡胚卵母细胞减数分裂的作用在E12.5分别以0,0.05,0.5和5 mg的浓度注射到鸡胚钝头蛋清中,继续孵化3天到E15.5.结果表明,0.05 mg的BPA可以显著提高鸡胚卵母细胞减数分裂相关基因(Stra8,Scp3和Dmc1)的表达.以 0.05 mg 的 BPA 注射到孵化到 E10.5,E12.5,E15.5和E17.5的鸡胚中,然后继续孵化到E12.5,E15.5,E17.5和E18.5收集卵巢组织,进行减数分裂基因检测和组织形态学观察.结果表明,BPA显著提高卵巢中卵母细胞减数分裂相关基因(Stra8,Scp和Dmc1)基因的表达(P<0.05).HE染色结果表明,BPA处理后,鸡胚卵巢皮质厚度增加,染色体凝聚变深,卵母细胞囊泡增大.γH2AX蛋白免疫荧光染色结果表明,BPA处理组的γH2AX的阳性率显著高于对照组(P<0.05).4.BPA注射对鸡胚卵母细胞Dazl和Stra8基因甲基化位点的影响通过BSP测序的方法检测卵巢中卵母细胞Dazl和Stra8基因甲基化位点的变化.结果表明,BPA可以促使DNA甲基化位点发生变化,BPA处理E12.5天的鸡胚后,卵巢中Dazl的DNA甲基化位点几乎不发生变化,而显著降低Stra8基因的甲基化程度(P<0.05);在胚胎期的E15.5天时,BPA可以显著降低Dazl和Stra8基因的甲基化程度.通过QRT-PCR检测BPA处理后,Dazl和Stra8的mRNA表达在E12.5和E15.5的表达水平显著提高(P<0.05).综上所述,BPA能够以类雌激素的活性促进鸡胚卵母细胞减数分裂以及原始卵泡的发育.通过降低DNA甲基化转移酶的表达和降低Stra8和Dazl基因的甲基化程度,从而促进减数分裂基因和原始卵泡发育相关基因的表达.BPA在体内能够与ERβ受体结合继而发挥类雌激素的活性,能够促进鸡胚卵母细胞启动减数分裂,进而促进卵-巢及原始卵泡的形成及发育.
- 作者：
- 徐雅丽
- 学位授予单位：
- 南京农业大学
- 专业名称：
- 动物遗传育种与繁殖
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2016年
- 导师姓名：
- 杜文兴
- 中图分类号：
- S859.8
- 关键词：
- 双酚A；鸡胚；卵母细胞；减数分裂；甲基化
- Bisphenol A； Chicken embryos； Oocytes； Meiosis； Methylation