猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及其表位鉴定分析
Development of Monoclonal Antibody Against Classical Swine Fever Virus and Identification of A Novel Epitope on E2 Protein of CSFV
猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高度接触性、致死性传染病.在CSFV编码的结构蛋白中,E2囊膜蛋白作为CSFV主要免疫原性蛋白,能够诱导机体产生中和抗体,是新型疫苗的主要研究对象,也是建立CSFV血清学检测方法的首选抗原.以CSFV E2蛋白作为免疫原制备的单克隆抗体具有病毒中和能力,在CSFV的生物学特性、抗原性及表位研究、免疫学诊断、流行病学研究等方面具有重要的应用价值.已有研究证明E2蛋白上存在多个抗原表位,包括线性表位和构象表位.为进一步对E2蛋白表位进行定位和分析,本研究采用杆状病毒表达猪瘟病毒C株E2蛋白作为免疫原蛋白,免疫BABL/c小鼠,通过细胞融合、筛选及亚克隆,获得4株抗CSFV E2蛋白单抗,分别命名为E2-1,E2-2,E2-3,E2-4.经测定4株单抗均属于IgG1亚型,轻链为κ链.制备腹水并纯化单抗,鉴定结果显示4株单抗抗体效价分别为1:102400、1:102400、1:204800、1:102400,而且均能与猪瘟C株发生反应,与BVDV无交叉反应,均能中和CSFV Thiveral株,其中单抗E2-3与Thiveral株的中和效价高达1.6*105倍.为进一步鉴定单抗识别的抗原表位,从所筛选的4株单克隆抗体中,选择病毒中和活性和效价最高的单抗E2-3进行表位鉴定.本实验采用PEPperMAP?表位图谱技术,按照猪瘟病毒C株E2全长(除跨膜区),用多肽重置的方法人工合成314条长度为15个氨基酸的多肽,制备多肽芯片,用单抗E2-3进行反应,发现存在一条9个氨基酸的特异性多肽序列(正在申请国家专利)与单抗E2-3特异性结合,且与国际上著名的单抗WH303表位(TAVSPTTLR)不在同一位点.为进一步确定该表位的关键氨基酸位点,本研究对筛选出来的特异多肽序列,采用氨基酸替换实验,将表位中氨基酸逐一替换,制备多肽芯片,与单抗E2-3反应分析.结果显示单抗E2-3与酸性氨基酸(D、E)和芳香族氨基酸(W、Y)亲和能力较强,而抗原表位中存在3个天冬氨酸(D)与之对应.因此推测该表位中的3个D可能为关键的结合位点.为了验证表位中的3个D是否为关键的结合位点,本实验在多肽水平表位鉴定的基础上进一步了研究3个D的作用机制.利用杆状病毒表达系统进行关键氨基酸突变表达试验,在杆状病毒CSFV E2蛋白转移载体上对3个D分别进行单一突变、双突变、三突变,对表达产物进行反应鉴定.结果显示单抗E2-3与突变后表达产物结合能力并未出现明显的下降,推测这3个D位点可能并不是关键氨基酸位点,而是由多个氨基酸位点共同决定,其作用机制还需进一步研究.为了确定单抗E2-3与不同基因亚型CSFV广谱性,实验中复壮分离了22株CSFV流行毒株,并对其进行E2基因主要编码区序列分析.发现22株流行毒株分属1.1、2.1和2.2三个基因亚型,并以2.1基因亚型毒株为主.而对22株CSFV流行毒株与单抗E2-3进行反应性分析后发现,单抗E2-3与三个基因亚型毒株均发生反应,证明单抗E2-3具有广谱性,但只与9株2.1亚型毒株不发生反应,说明不同流行毒株之间存在一定抗原谱差异.综上所述,本研究制备了4株特异性抗CSFV E2蛋白单克隆抗体,均具有病毒中和活性.对其中的一株抗体效价最高的单抗E2-3进行抗原表位鉴定,确定了一个不同于国际上著名的单抗WH303的线性表位(正在申请专利);采用氨基酸替换和突变研究,发现鉴定表位中的3个D并不是关键位点,推测可能是由多个氨基酸共同影响单抗E2-3的结合能力;同时,通过该单抗E2-3与不同流行毒株反应性分析,证明CSFV流行毒株具有不同的抗原谱.
- 作者：
- 孙永芳
- 学位授予单位：
- 中国兽医药品监察所
- 专业名称：
- 预防兽医学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2017年
- 导师姓名：
- 王琴
- 中图分类号：
- S852.65
- 关键词：
- CSFVE2蛋白；单克隆抗体；抗原表位
- CSFV E2 protein; monoclonal antibody; epitope;