山羊痘病毒南疆株P32蛋白的表达及KLP2基因缺失表达载体的构建
The Prokaryotic Expression of the P32 Protein and the Deleted Expression Vectors Construct of the KLP2 of Goatpox Virus of Southern Xinjiang Strains
羊痘是由羊痘病毒(Capripoxvirus,CaPV)引起的病毒性中最严重的一种,世界动物卫生组织(OIE)规定羊痘为必须通报疫情的重大动物疫病之一,我国将其列为一类动物疾病.羊群的感染率和致死率均很高,严重影响养羊业的发展.2010年,新疆南疆多地暴发羊痘,造成约1.5万只羊只死亡,致病率和病死率分别为34%和65%.本论文对此次疫情及病原特性进行了初步研究.首先,制备了胎羊皮肤原代细胞分离病毒.(1)胎羊皮肤原代细胞的制备:从本地牛羊屠宰场采取健康母羊的胎羊,分离胎羊皮肤,经充分剪碎、清洗、消化等步骤后分散细胞,加入含10%FBS的DMEM细胞培养液,在37℃,5%CO2培养箱中培养制备原代细胞,并连续传代对胎羊皮肤细胞的培养特性进行了研究.(2)病毒的分离培养:取2010年羊痘疫情中采集的病羊皮肤,剪碎研磨后取匀浆上清接到胎羊皮肤细胞中,加双抗(青霉素、链霉素),37℃,5%CO2培养箱中,加2%FBS的DMEM培养,观察出现明显的CPE后冻融收毒,并继续盲传6代,再逐代提取病毒基因组后用PCR检测.其次,进行了山羊痘病毒P32蛋白的表达:P32蛋白是羊痘病毒的膜蛋白.为了研究新疆南疆分离的山羊痘病毒P32基因的特征,通过PCR扩增得到P32基因全长、膜外区P32mw以及亲水区P3228-20,构建了表达载体pET42b-P32、pET42b-P32mw以及pET28a为载体的pET28a-P32-20并进行原核表达,并对其核苷酸序列的同源性和遗传进化关系,及其推测的氨基酸序列、蛋白二级结构进行了预测分析.再次,构建山羊痘病毒KLP2基因缺失表达载体.首先克隆两端带侧翼序列的全长2300bp的KLP2基因于pGEM-T载体中,用Hind III酶切除去KLP2中约1000bp的基因片段,然后将以融合PCR扩增的VV-7.5为启动子和GFP报告基因的融合基因片段插入以上Hind III酶切的载体中,得到重组缺失转移载体PGEM-KLP2-VV7.5-GFP.结果显示:(1)胎羊皮肤细胞贴壁生长,初期呈三角形或梭形,随着细胞密度的增加,逐渐变为长梭形紧密排列.前期细胞生长良好,细胞界限清晰整洁,4天左右可以传代一次.从第七代开始,细胞生长周期变短,较易脱落,有死细胞漂浮.3天甚至2天即需传代.本研究传代至第13代,虽然还可以生长,但大量的死细胞脱落导致无法进一步研究.(2)接种羊痘后,48h开始出现细胞病变,96h达到90%,病毒CPE为细胞变细长,细胞间隙变大,或部分细胞浓缩变圆.所有传代病毒的细胞培养物基因组,用P32引物检测,其结果均为阳性.(3)山羊痘病毒P32基因的测序结果可看出:山羊痘病毒南疆株P32基因发生了较大的突变,相对对照在第100-105位增加了6个核苷酸,编码K、N两个氨基酸,与Gansu2009株相似.跨膜分析显示P32蛋白膜外区为1-282aa,跨膜区283-305aa,膜内区为306-324aa.蛋白二级结构分析发现其分子两端呈现明显的疏水结构,抗原性较弱,而中间区域有较强的亲水性和较强的抗原性.蛋白表达发现其全长在大肠杆菌中几乎没有表达,其膜外区可以包涵体形式进行表达,但表达量较低,难以纯化.(4)构建出山羊痘病毒KLP2基因缺失表达载体后,培养BHK-21传代细胞,将重组缺失质粒转染入BHK-21细胞中,可观察看见细胞中表达的绿色荧光,说明本研究成功构建了KLP2基因缺失表达载体.本文通过研究揭示了山羊痘病毒南疆株基因构成的特点和蛋白表达的情况,为深入了解P32蛋白,进一步研究山羊痘病毒及羊痘病毒基因工程亚单位疫苗奠定基础.并且山羊痘病毒KLP2基因缺失表达载体的构建工作的完成也为KLP2基因缺失疫苗的研究提供了很重要的帮助.
- 作者：
- 宋书婷
- 学位授予单位：
- 塔里木大学
- 专业名称：
- 兽医(专业学位)
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2017年
- 导师姓名：
- 李有文
- 中图分类号：
- S852.65
- 关键词：
- 山羊痘病毒；P32蛋白；原核表达；病毒分离；KLP2基因；基因缺失
- goatpox virus; P32 protein; prokaryotic expression; Viral isolation; KLP2 gene; gene deletio;