重组大肠杆菌和重组谷氨酸棒状杆菌生产番茄红素的研究
Studies on Lycopene Production by Recombinant Escherichia Coli and Recombinant Corynebacterium Glutamicum
番茄红素是一种重要的类胡萝卜素,具有良好的抗氧化、抗肿瘤、抗炎等生理和药理活性,因此广泛应用于功能性食品、饲料、营养制品、药品和化妆品中.近年来,随着人们对化学合成品毒副作用的担心及对天然产品的日益崇尚,微生物发酵法生产番茄红素,逐渐受到研究人员的重视.在本研究中,对一株实验室保存的可以有效利用果糖大量生产番茄红素的大肠杆菌重组菌E.coli K12f-pACLYC进行研究.以添加6 g/L葡萄糖培养条件为对照,添加6 g/L果糖培养条件为实验组,进行发酵实验,对照组番茄红素产量为45 mg/gDCW,实验组番茄红素产量为177.4 mg/gDCW.对该重组菌实验组跟对照组对数中后期转录组进行测序,分析番茄红素合成相关代谢通路的基因差异表达.385个基因出现4倍以上差异表达,富集于EMP途径,三羧酸循环,氧化磷酸化途径等代谢途径.对相关代谢通路基因表达模式分析,该重组大肠杆菌利用果糖大量生产番茄红素原因如下,第一,EMP途径中的三磷酸甘油醛和丙酮酸的大量积累,从而产生积累了较多的前体物质.第二,三羧酸循环和氧化磷酸化代谢途径大量基因显著上调,为菌体生长和番茄红素的合成提供了大量的NADH和ATP;第三,促进NADH转换为NADPH的基因pntA上调显著,可以产生充足的NADPH帮助该菌株有效的合成番茄红素.同时,本研究通过实时荧光定量PCR方法对代谢通路中11个关键基因的表达情况进行分析,验证了转录组数据分析的可靠性.此外,在本文中,我们对谷氨酸棒状杆菌ATCC 13022进行了改造.构建了含有来自草生欧文氏菌的番茄红素合成酶基因crtB,crtI的pEC-XK99E-crtBI重组表达载体并通过电转化导入到谷氨酸棒状杆菌中,诱导表达后,未检测出番茄红素的产生.考虑到野生型谷氨酸棒状杆自身的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因Cg10626的表达量比较低,将来自草生欧文氏菌的crtE基因也构建到pEC-XK99E中得到pEC-XK99E-crtEBI组表达载体.IPTG诱导剂浓度1 mM,诱导温度25 ℃,诱导8h,对发酵液进行检测,番茄红素最大浓度为31.43 mg/l.本研究为首次使用谷氨酸棒状杆菌为宿主菌合成番茄红素.
- 作者：
- 杜稳
- 学位授予单位：
- 天津科技大学
- 专业名称：
- 微生物与生化药学(理)
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2016年
- 导师姓名：
- 张同存
- 中图分类号：
- TQ920.1
- 关键词：
- 大肠杆菌K12f-pACLYC；番茄红素；果糖；转录组分析；代谢通路；谷氨酸棒状杆菌；重组细菌
- Escherichia coli K12f-pACLYC; Lycopene; Fructose; Transcriptome analysis; Metabolic pathway; Corynebacterium glutamicum; Recombinant strain;