耐酸和耐热苏氨酸菌株构建
Construction of Acid and Heat-resistant Threonine Strain
L-苏氨酸是人体必需氨基酸之一,是构成蛋白的重要组成部分,广泛应用于食品、饲料和医疗等方面.大肠杆菌发酵过程中,维持较低的pH和较高的发酵温度,可以节约流加的液氨和冷却水用量.若发酵液在较低pH时放罐,对于浓缩、等电结晶工艺来讲,可以节省中和所用的硫酸.因此,发酵过程pH和温度的控制有利于降低氨基酸生产过程中的能源消耗.本文对大肠杆菌耐酸系统(ARs)进行分子改造,使大肠杆菌在酸性环境生存下来;对HSP20小热激蛋白、四氢嘧啶合成途径的引入,可以较大程度提高了大肠杆菌的耐热性能;从而使L-苏氨酸高产菌E.coli THRD在低pH、高温条件下有更高的L-苏氨酸产量.以L-苏氨酸高产菌THRD为出发菌株,利用大肠杆菌的AR2或AR3耐酸系统进行分子改造,构建菌株 THRD(pTrc99a-gadBC)、THRD araABD::gadBC、THRD(pTrc99a-LGOX)、THRD(pTrc99a-arcA)、THRD araABD::arcA.对耐酸改造菌株进行发酵验证,在5 L分批补料发酵过程中,发酵初始pH7.0,在发酵前中期维持pH7.0,在发酵后期24 h左右,停止流加氨水,pH降到6.0以前不调节pH.PH降到6.0之后,维持pH6.0发酵.发酵结束时,THRD(pTrc99a)产量达到100±1g/L,糖酸转化率32.9%;THRD(pTrc99a-gadBC)、THRD(pTrc99a-arcA)、THRD(pTrc99a-LGOX)的L-苏氨酸产量达到106±2 g/L、115±3 g/L、110±2 g/L,糖酸转化率达到34.7%、36.9%、36.5%,相较于THRD(pTrc99a)的产量和菌体糖酸转化率分别提高了分别提高了 6.0%、15.0%、10.0%和 5.6%、12.3%、10.9%.THRD araABD::gadBC、THRD araABD::arcA菌株发酵12 h后,生物量增长速率、L-苏氨酸的生成速率明显减低,菌株增长缓慢.几株耐酸改造苏氨酸生产菌,发酵结果显示,AR2耐酸系统和AR3耐酸系统的改造有利于在酸性条件发酵L-苏氨酸的高产.以L-苏氨酸高产菌THRD为出发菌株,对耐热因子进行分子改造,构建菌株THRD(pTrc99a-ectABC)、THRD(pBV220-hsp20).对耐热改造菌株,在5L分批补料发酵过程中,发酵初始温度37℃,在发酵前中期维持温度37℃,在发酵12h-14h左右,OD600(30-35),调整温度为40℃,维持温度40℃发酵.发酵结束后,THRD(pBV220-hsp20)苏氨酸产量达到129 g/L,糖酸转化率达到37.1%,相较于THRD(pBV220)菌株的L-苏氨酸产量和菌体糖酸转化率较原菌分别提高了 7.5%和6.9%;THRD(pTrc99a-ectABC)的生物量是 15.58 g DCW/L,THRD(pTrc99a)的生物量是11.97 g DCW/L.THRD(pTrc99a-ectABC)苏氨酸产量达到125 g/L,糖酸转化率达到40.3%,相较于THRD(pTrc99a)菌株的L-苏氨酸产量和菌体糖酸转化率较原菌分别提高了9.60%和11.14%.表明ectA、ectB、ectC基因,hsp20基因的过表达,有利于增加菌株在高温条件下发酵单位发酵时间内L-苏氨酸的产量.
- 作者：
- 郑会明
- 学位授予单位：
- 天津科技大学
- 专业名称：
- 工程硕士(全日制)(专业学位)
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2016年
- 导师姓名：
- 谢希贤
- 中图分类号：
- Q93
- 关键词：
- L-苏氨酸；大肠杆菌；耐酸系统；耐热；分子改造
- L-threonine; Escherichia coli; acid-resistant system; heat-resistant; molecular modification;