1型和3型鸭甲型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增检测研究
Study on Detection of Duck Hepatitis a Virus Types 1 and 3 Using Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification
鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis,DVH)是由鸭甲型肝炎病毒(Duck Hepatitis A Virus,DHAV)引起的一种急性接触传染性疾病,发病急、死亡率高、肝脏病变是该病的主要特征.DHAV主要侵染3周龄以内的雏鸭,蔓延全世界,分布广.在我国,主要流行DHAV-1和DHAV-3两种病毒,对养鸭业造成很大危害.由于DHAV-1和DHAV-3两种病毒在血清学上不发生交叉反应,也是两种不同的血清型.两种病毒所感染的雏鸭在发病后临床症状和死亡后病理变化十分相似,给该病的诊断和防治造成了很大的困难.针对鸭甲型肝炎病毒的检测方法主要是病毒分离鉴定、血清学检测、RT-PCR检测等方法,这些方法操作繁琐、费时费力,需要昂贵的仪器,不适合进行基层检测.环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)是日本学者Notomi T于2000年发明的一种新的DNA扩增技术,该方法针对靶序列上6个特定的基因片段设计4条引物,在Bst DNA聚合酶的作用下等温条件(65℃)保温几十分钟即可完成核酸扩增反应,具有高效、特异、快速、使用方便等优点.本研究通过分析基因文库中的DHAV-1和DHAV-3的VP1基因序列,用生物信息学软件Seq Man进行序列分析,综合各位点的碱基情况,各自选取出现频率最多的碱基作为默认碱基分别得出一条consesus序列;用DNAMAN对这两条序列进行比对,分别选择碱基序列差异较大的一段作为模板.根据LAMP引物设计原则,利用在线软件Primer Explore V4分别设计出针对各自VP1基因片段的LAMP特异性引物,每组引物包括两条外引物F3/B3,两条内引物FIP/BIP和两条环引物LF/LB.分别将DHAV-1和DHAV-3 VP1基因连接至p GEM-T载体上,通过体外转录得到各自的VP1基因RNA样本溶液.以体外转录的RNA样本溶液为模板,对反应体系中的Mg2+浓度、d NTPs浓度、betaine浓度、引物浓度比例、反应温度和时间等条件进行优化;根据2%琼脂糖凝胶电泳条带的亮度进行结果筛选,确定各反应体系的最佳浓度.通过向反应体系中添加指示剂羟基萘酚蓝(HNB)实现了反应结果的可视化观察.从而分别建立了DHAV-1 RT-LAMP和DHAV-3 RT-LAMP检测方法.特异性试验结果显示,DHAV-1 RT-LAMP和DHAV-3 RT-LAMP检测方法只与同型病毒株发生阳性反应,而与异型病毒株和其他鸭源病原均为阴性反应.敏感性试验结果显示,所建立的DHAV-1 RT-LAMP检测方法最低可检测到的RNA模板量为100拷贝/μL,是RT-PCR方法的100倍;DHAV-3 RT-LAMP检测方法最低可检测到的RNA模板量为10拷贝/μL,是RT-PCR方法的1000倍;对已知DELD50的DHAV鸭胚病毒液进行RT-LAMP试验结果显示,该方法最低可检测到相当于4.2个DELD50的DHAV-1和相当于1.1个DELD50的DHAV-3.使用已建立的DHAV-1 RT-LAMP和DHAV-3 RT-LAMP检测方法对采集自人工感染雏鸭和野外雏鸭的样品进行检测.结果显示,用DHAV-1和DHAV-3感染雏鸭后,在血清、肝脏样品中可以检测到相应病毒RNA,且两种病毒相互之间不发生交叉反应;对不同时间的血清样品检测结果显示,在感染后16 h即可用RT-LAMP方法检测到血清中相应的病毒RNA,在感染后22 h的血清样品和发病死亡雏鸭的肝脏样品中,均可检测到相应的病毒RNA.对人工感染22h前的雏鸭粪便样品和野外雏鸭粪便样品的检测表明,所有样品均为阴性反应.初步应用表明,所建立的RT-LAMP方法能够对感染鸭甲型肝炎病毒的雏鸭血清和病死鸭肝脏样品进行早期快速检测,并能够鉴别1型或3型鸭甲型肝炎病毒,为鸭病毒性肝炎的快速诊断及进行相应的疫苗和抗血清预防提供重要依据.
- 作者：
- 张映
- 学位授予单位：
- 中国兽医药品监察所
- 专业名称：
- 预防兽医学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2016年
- 导师姓名：
- 范书才
- 中图分类号：
- S858.32
- 关键词：
- 鸭甲型肝炎病毒；逆转录环介导等温扩增；检测方法；应用
- DHAV; RT-LAMP; detection; application;