双靶向RNAi提高番茄抗病毒复合侵染能力的研究
番茄是茄科番茄属植物,作为食用蔬果全球广泛性种植.番茄病毒病严重影响番茄的产量及产品品质.其中烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒是番茄10多种主要毒源之首,普遍危害世界各番茄种植区,常以单独侵染或复合侵染形式危害植株.目前常用的方法是培育抗病品种或繁殖脱毒苗.RNA干涉技术作为基因工程技术之一,其应用优点逐步展现,因其高效特异性、可遗传性及生物安全性成为备受关注的抗病育种手段之一.试验依据RNA干扰机制构建针对TMV和CMV双靶向的RNA干涉双元载体系统.方法:以TMV、CMV病毒基因作为RNA干扰靶标基因,针对病毒株系间基因同源区域设计靶标基因目的序列引物.以复合感染TMV和CMV病毒的番茄叶片提取植物总RNA.经RT-PCR分别获得TMV和CMV的目的序列c DNA.介助T载体将两段靶序列连接成一条DNA序列.酶切后依次正向、反向锚定连接到PUCC-RNAi中间载体的克隆位点,形成靶序列在载体中的双向重复结构;酶切后插入到p C2300-35S-OCS表达载体中,重组质粒电击转化到根癌农杆菌感受态细胞中,完成RNAi双元载体系统的构建.选取无菌番茄幼苗的叶片和下胚轴为外植体,农杆菌介导法侵染番茄后组织培养.经抗生素选择培养基筛选出25株抗性植株,特异性引物PCR和35S启动子进行PCR检测,获得RNAi转基因番茄苗7株.人工接种TMV、CMV病毒并调查感病状况.结果表明:转基因番茄对TMV及CMV的抗病能力比对照番茄显著提升.选取具抗病毒能力的转基因番茄苗3株,普通对照番茄苗2株.提取植物总RNA进行一步法荧光定量PCR.结果表明:接种病毒后转基因番茄体内TMV与CMV病毒基因的m RNA表达量明显低于对照品种,表明RNAi转基因番茄对TMV、CMV抗性基于RNAi引起的病毒基因转录产物降解.
- 作者：
- 尹蕾
- 学位授予单位：
- 牡丹江师范学院
- 专业名称：
- 微生物
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2016年
- 导师姓名：
- 律凤霞
- 中图分类号：
- S436.412
- 关键词：
- 番茄；烟草花叶病毒；黄瓜花叶病毒；载体构建；基因转化
- Tomato; Tobacco mosaic virus; Cucumber mosaic virus; Vector construction; Gene transformation;