小菜蛾腺苷受体基因在PxAdoR在N~6-(2-羟乙基)腺苷杀虫过程中的作用研究
利用虫生真菌或其毒力因子来防治害虫是害虫生物防治研究的热点之一,关键问题是要揭示病原真菌的毒力因子如何作用于昆虫.蝉花虫草(Isaria cicadae Mique),其代谢产物N6–(2–羟乙基)腺苷[N6–(2–hydroxyethyl)–adenosine,HEA]对小菜蛾具有一定的杀虫活性,表现为蝉花虫草分生孢子寄生小菜蛾类似的拒食,发育迟缓和致死等现象.本文利用前期抑制性消减杂交法得到的差异表达片段设计特异性引物,克隆小菜蛾腺苷受体(Plutella xylostella adenosine receptor,PxAdoR)基因.并根据克隆得到的全长序列设计特异性引物合成含有目的基因片段的dsRNA进行RNAi,通过荧光定量PCR分析HEA对PxAdoR基因相对表达量的影响.利用HEA及哺乳动物腺苷受体A2a R抑制剂SCH58261处理小菜蛾2龄幼虫结合RNAi技术研究HEA与PxAdoR受体之间的作用关系.主要结果如下:1.腺苷受体基因PxAdoR克隆及特征分析利用HEA作用于小菜蛾获得差异表达的片段设计特异性引物,采用RT–PCR和RACE技术从小菜蛾中克隆全长1828 bp的小菜蛾腺苷受体基因,并通过生物信息学软件预测和分析蛋白质结构,显示其蛋白分子量为49.2 k Da,没有信号肽,疏水性不稳定蛋白,并且具有7次跨膜螺旋结构的一类G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCRs).并通过NCBI比对发现与哺乳动物的腺苷受体存在差异与昆虫腺苷受体更相似.2.HEA激活PxAdoR对小菜蛾致死率和体重增长的影响根据克隆得到的全长序列设计特异性引物合成含有目的基因片段的dsRNA,通过喂食的方法导入小菜蛾二龄幼虫体内,起到抑制目的基因PxAdoR表达的作用,再通过1 mg/ml的HEA连续喂食60 h,并取样通过荧光定量PCR检测经过HEA处理后PxAdoR相对表达量情况.结果表明:HEA处理后PxAdoR基因的表达量与对照组有极显著差异,比对照组高了4.3倍,而通过喂食dsRNA后再经过HEA处理的小菜蛾与CK组比有显著的升高,但比HEA组低.表明HEA能有效激活PxAdoR基因的表达.1 mg/ml的HEA对小菜蛾二龄幼虫具有明显的致死性,而施加包含目的基因的双链RAN(PxAdoR–dsRNA)或喂食腺苷受体抑制剂SCH58261在36,48,60h能明显降低HEA对小菜蛾幼虫的死亡率和体重增长抑制率.特别是在48 h处,喂食双链RNA的RNAi干扰组的体重增长抑制率比喂食HEA组低了3.5倍,而腺苷受体抑制剂SCH58261组的校正死亡率比HEA组低了2倍.且在HEA处理后PxAdoR基因的表达量明显上调.表明HEA能激活PxAdoR起到抑制小菜蛾体重增长的作用,并出现一定的致死作用.
- 作者：
- 方鸣
- 学位授予单位：
- 安徽农业大学
- 专业名称：
- 森林保护学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2016年
- 导师姓名：
- 柴一秋；黄勃
- 中图分类号：
- S433.4
- 关键词：
- N6–(2–羟乙基)腺苷；RNA干扰；小菜蛾腺苷受体；基因克隆；蛋白结构
- N6-(2-hydroxyethyl)-adenosine； RNA interference； Plutella xylostella adenosine receptor； gene clone； protein structure