家蚕N-酰胺基葡萄糖基转移酶cDNA的克隆与表达特征分析
葡萄糖基转移酶(GlcNAcases)是一组主要催化N-糖链生成的酶类,主要分布在生物细胞中的高尔基体和内质网上.能够对各类糖类以及非糖类等大分子进行修饰加工,从而实现其各类分子的生物学功能.昆虫的GlcNAcases在多种生理生化过程中都起非常重要的作用,包括对外源性和内源性细胞底物进行合成、分解、加工和修饰等许多方面.本研究对家蚕的GlcNAcases的cDNA进行了克隆、原核表达以及组织表达等分析.主要研究结果如下:1、根据家蚕基因组及相关数据库的GlcNAcases序列信息,设计特异性引物,克隆获得了目的基因.序列分析表明该基因ORF包含1113个碱基,编码370个氨基酸,具有GlcNAcase催化功能的结构域包含45个氨基酸序列,属于糖基转移酶基因家族.构建该基因系统进化树,结果表明,所克隆的家蚕的目的基因序列与鞘翅目昆虫GlcNAcases同源性最高,命名为BmGlcNAcase A.2、将目的基因产物连接到质粒pET-28A(+)表达载体上,并构建重组质粒pET-28A-BmGlcNAcaseA,转化感受态细胞DE3.优化表达条件诱导其在大肠杆菌中进行原核表达.经过SDS-PAGE和Western Blot分析,结果表明,目的蛋白得到成功表达.利用NI-NTA亲和层析柱对获得的重组蛋白进行蛋白纯化并制备多克隆抗体,获得的抗体效价为11400.3、经RT-PCR和Western Blot检测表明BmGlcNAcase A在家蚕组织水平的表达存在差异.BmGlcNAcaseA在卵巢和表皮表达量最高,其次是在中肠和脂肪体,血液、精巢和马氏管表达最少.BmGlcNAcaseA家蚕表皮生长期间表达量显著上升,家蚕BmGlcNAcaseA基因可能与家蚕的表皮生长有关.4、家蚕5龄幼虫经核型多角体病毒、藤黄微球菌、白僵菌以及大肠杆菌的处理后,BmGlcNAcaseA基因表达量总体呈现先下降后上升的规律.BmGlcNAcaseA对病毒的反应较敏感,而对其他三种菌的应答比较慢.经核型多角体病毒刺激处理后的BmGlcNAcaseA基因表达量在6 h左右达到最高,其它三种菌则是在9 h左右达到峰值,并都在12 h左右降到最低,以上结果预示着BmGlcNAcaseA可能参与了外原微生物引起的家蚕免疫应答过程.综上所述,BmGlcNAcase A在不同组织中的表达水平存在差异性,这与其在组织中的功能密切相关.本文对BmGlcNAcaseA的克隆表达为下一步研究其在家蚕以及昆虫中功能作用奠定基础.
- 作者：
- 金栉曦
- 学位授予单位：
- 安徽农业大学
- 专业名称：
- 生物化学与分子生物学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2016年
- 导师姓名：
- 魏国清；刘朝良
- 中图分类号：
- S881.2；Q78
- 关键词：
- 家蚕；葡萄糖基转移酶；cDNA克隆；蛋白表达；功能分析
- silkworm； N-acetyl glucosamine transferase； cDNA clone； gene expression； function analysis