2014-2015年上海地区犬细小病毒分离鉴定及基因分型

犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的一种急性、接触性传染病,属于犬的主要烈性传染病之一,具有传染性强、发病率和死亡率高等特点.犬细小病毒从1978年发现以来,由于其变异速率快,宿主范围不断扩大,给其防治增加了困难,严重影响了我国经济动物养殖业的健康发展.首先,本论文根据CPV的VP2基因序列保守区设计一对特异性PCR引物,对采自上海及周边地区的30株CPV进行分子鉴定和基因分型,检测结果表明:New CPV-2a 20株(20/30)占67%,New CPV-2b 7株(7/30)占23%,CPV-2c 3株(3/30)占10%.由此可以看出,目前上海地区CPV主要以New CPV-2a和New CPV-2b基因型为主,同时也出现了CPV-2c基因型.对其VP2基因序列分析发现6个核苷酸突变导致氨基酸发生变化,3株CPV-2c在相同位点发生突变,7株New CPV-2b也在相同的位点发生了突变.系统进化树看出我国犬细小分离株与国外分离株属于不同分支.其次,为了进一步探究上海地区三种基因型CPV的遗传变异和分子致病机理,本论文分别选取三种基因型的分离株:SH14株(New CPV-2a)、SH1515株(New CPV-2b)和SH1516株(CPV-2c)为研究对象,将这三株CPV的小肠组织研磨,运用同步接种方法接种CRFK细胞,分离病毒;然后,分别利用PCR和病毒学方法对病毒进行鉴定.结果发现,三种基因型CPV均可在CRFK细胞上良好生长,并产生细胞变圆、脱落等特征性细胞病变;PCR方法均能检测到CPV基因组;间接免疫荧光试验和蛋白质印迹试验均证明病毒VP2蛋白在CRFK细胞中进行了表达;在电镜下可以观察到直径在20nm左右,具有细小病毒形态特征的病毒颗粒;将分离的病毒接种试验动物,发现在攻毒后3天,可以从试验犬粪便中检测到CPV,并持续排毒一周.所分离三种基因型CPV在CRFK细胞中的病毒滴度(TCID50)分别为10-4.9/0.1mL(SH14株)、10-4.8/0.1mL(SH1515株)、10-4.6/0.1mL(SH1516株).为进一步了解三种基因型CPV在细胞中的增殖特性,本研究分别测定了它们在CRFK细胞中的一步生长曲线,结果表明三种基因型CPV在CRFK细胞上增殖规律相似:即病毒在感染细胞后0-12h为潜伏期,12h后病毒粒子开始增殖,36h到60h为病毒快速增殖期,病毒滴度在感染后60h后达到最高,72h后随着细胞的裂解和死亡,病毒滴度开始下降.最后,根据三种基因型CPV参考株序列,我们设计5对特异性PCR引物,从分离的三种基因型CPV中成功扩增出它们的全基因组序列.其中SH14株(New CPV-2a)全长5062bp,SH1515株(New CPV-2b)全长5014bp,SH1516株(CPV-2c)全长5002bp.利用DNASTAR软件对基因序列进行了比对分析,结果显示三种基因型CPV基因组均含有两个编码框架:ORF1和ORF2,分别编码NS1、NS2、VP1、VP2四种蛋白.其中ORF1编码的NS1长2007bp,中间包含498bp的NS2基因,分别编码669和166个氨基酸.ORF2编码VP1长2184bp,其中包含1755bp VP2基因,分别编码728和585个氨基酸.三株病毒3'端和5'端序列存在差异,和其它细小病毒一样,三株病毒两端存在两个非编码区,并存在典型的"Y"型发卡结构.对三种基因型CPV同源性进行分析,结果显示SH14株(New CPV-2a)与CPV/CN/SD10/2014株核苷酸同源性最高,达98.8%;SH1515株(New CPV-2b)与CPV/CN/JL6/2013株和CPV/CN/HB1/2013核苷酸同源性最高,达99.9%;SH1516株(CPV-2c)与CPV-LZ2(2b)株核苷酸同源性最高,达99.2%;从系统发生树可以看出:CPV在不断的进化过程中逐渐形成了不同的分支,其中,我国犬细小不同分离株之间亲缘性相对较近,位于同一大的分支,而与国外分离株的亲缘性相对较远.综上所述,本论文分离鉴定到流行于上海地区的三种基因型CPV,并对它们的增殖特性和全基因组序列进行了测定和分析.结果表明上海地区流行的CPV仍然以New CPV-2a和New CPV-2b型为主,但我们也在上海和合肥地区的发病犬体内发现CPV-2c型,这提示CPV在长期进化和免疫压力下已经发生了变异,这可能也是临床上CPV感染病例逐渐增多和免疫犬发病的重要原因之一.本研究结果为研究我国CPV的流行病学、致病机理及新型疫苗等提供了有益的参考资料.