慢病毒介导的牛病毒性腹泻病毒E0蛋白在MDBK细胞中表达
牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)为黄病毒科(Flaviviridae),瘟病毒属(Pestivirus)成员,其感染的宿主范围较广,包括牛、羊、鹿、猪等.黄病毒科成员之间基因组的同源性较高,血清学上存在交叉反应,并能够突破宿主特异性发生交叉感染,从而增加了该病原的诊断和疾病预防的难度.序列分析表明BVDV E0基因的保守性较高,E0蛋白具有一定的免疫原性,此外该蛋白还具有RNase活性,因此成为研究疾病感染机制、开辟防治疾病新途径的主要靶蛋白,同时也具备生产基因工程诊断抗原和基因工程亚单位疫苗的潜力.本研究通过比对GenBank中登录的22株BVDV E0基因序列,其中牛源病毒12株:Oregon C24V(AF091605.1)、NADL(AJ133738.1)、Singer(DQ088995.2)、SD1(M96751.1)、Osloss(M96687.1)、Changchun 184(JN704144.1)、JZ05-1(GQ888686.2)、SH2210-17(HG426493.1)、GS5(KJ541471.1)、Powder(JN380089.1)、Riems(AY078406.1)、10JJ-SKR(KC757383.1),羊源病毒6株:VM(U75982.1)、21372(U75976.1)、R2727(U00891.1)、Ind51966(EU371402.1)、47(U75978.1)、21800(U75977.1),猪源病毒3株:SD0803(JN400273.1)、ZM-95(AF526381.3)、SH-28(HQ258810.1)以及鹿源病毒1株:CCSYD(FJ555203.1).选择我国最早分离且流行较为广泛的1b基因亚型的Changchun 184株E0基因序列进行合成.根据E0核酸序列设计并合成引入IgK信号肽、预测信号肽、His标签以及NheⅠ酶切位点的上下游引物,以pGSI-E0为模板,通过PCR分别扩增出含有IgK信号肽、预测信号肽以及不含信号肽的E0核酸序列,NheⅠ单酶切后与pZJ-CMV-eGFP载体连接,分别构建出含IgK信号肽的pZJ-CMV-eGFP-IgK-E0载体,含预测信号肽的pZJ-CMV-eGFP-Pre-E0载体以及不含信号肽的pZJ-CMV-eGFP-E0载体.PCR、酶切及测序鉴定后,与包装载体(pVsvg、pAX2)共转染HEK-293T细胞,收集并浓缩三种重组慢病毒,测定重组慢病毒滴度后感染MDBK细胞,进行荧光观察,收集MDBK细胞培养上清进行western blot分析,结果表明IgK信号肽组和预测信号肽组MDBK细胞均分泌表达E0蛋白,重组E0蛋白分子量大小约为40ku.为检测整合到MDBK细胞染色体中E0基因的拷贝数,本研究采用Oligo6.0软件设计出SYBR GreenⅠ染料法定量PCR检测BVDV E0基因的引物,以合成的pGSI-E0重组质粒为标准品,经过条件优化,在特异性试验中该方法对猪瘟病毒、鹿流行性出血病毒-5、蓝舌病病毒(1、5、20型)均未出现非特异性扩增,该方法最低检出线为20 copies/μL.重复性试验中组内重复Ct值标准差在0.0180.055之间,变异系数在0.110.16%之间;组间重复Ct值标准差在0.0370.096之间,变异系数在0.170.19%之间.结果表明本研究建立的BVDV E0基因定量PCR检测方法具有较好的特异性、灵敏性和重复性.将pZJ-CMV-eGFP-Pre-E0组和pZJ-CMV-eGFP-IgK-E0组MDBK细胞系连续传代,每代消化后均进行细胞计数,调整细胞浓度为1*106个/mL,每隔2代采集细胞样品2份,200μL/份,其中1份进行流式荧光分析,另1份提取细胞基因组并进行E0基因拷贝数检测.传代稳定性分析结果表明,两组细胞在第12代之后荧光率显著下降,15代之后E0基因拷贝数显著下降.两组细胞冻存前后荧光率未发现显著变化,因此本研究建立的两组分泌表达BVDV E0蛋白的MDBK细胞系具有较好的传代、冻存稳定性.总之,本试验成功构建了稳定分泌表达BVDV E0蛋白的MDBK细胞系,并建立了BVDV E0基因定量PCR检测方法,为研究E0蛋白的生物学功能、探索牛病毒性腹泻病毒的防控措施以及开发基因工程诊断抗原和基因工程亚单位疫苗的奠定了基础.
- 作者：
- 刘军
- 学位授予单位：
- 安徽农业大学
- 专业名称：
- 预防兽医学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2015年
- 导师姓名：
- 魏建忠；章金刚
- 中图分类号：
- S852.65
- 关键词：
- 牛病毒性腹泻病毒；E0蛋白；慢病毒载体；MDBK细胞；分泌表达
- Bovine viral diarrhea virus； E0 protein； lentiviral vector； MDBK cell； secretory expression