AMH对猪卵泡膜细胞类固醇激素合成酶的影响及其机制研究

抗缪勒氏管激素(anti-müllerian hormone,AMH)是转化生长因子β(transforming growth factor,TGF-β)超家族成员之一,由生长卵泡中的颗粒细胞分泌,能够抑制原始卵泡的募集和降低生长卵泡对促卵泡素的敏感性,但其作用机制尚不清楚.猪是医学试验上理想的动物模型,为了深入探讨AMH在对猪卵泡膜细胞在类固醇合成上的作用,开展了如下实验:试验一:AMH在猪上的表达模式本试验主要采用RT-qPCR技术,分析了AMH及AMHR在猪不同组织器官上以及在不同卵泡直径上的表达规律;利用ELISA技术,分析了在不同直径卵泡液中AMH的表达规律.试验结果表明:AMH及AMHR2在猪睾丸和卵巢中高表达,而在其它组织中不表达或表达量极低.颗粒细胞中AMH mRNA水平和卵泡中蛋白水平均呈现随着卵泡直径的增大,AMH的表达量逐渐降低;在大卵泡(>5mm)颗粒细胞中,AMHR2表达量最高(P<0.05),而小卵泡及中卵泡(直径1-5mm)的颗粒细胞中AMHR2的表达量最低,且无明显差异(P>0.05).这说明,AMH及AMHR2的表达量与卵泡的生长发育阶段有关.试验二:猪卵巢卵泡膜细胞的分离纯化和培养采用三种方法进行了猪卵泡膜细胞的优化,方法A:注射针头刮去颗粒细胞层,方法B:手术剪碎膜细胞层.A和B法均用IV型胶原酶消化后percoll密度梯度离心获取44%和35%中间层为膜细胞,C法直接将膜细胞层用IV型胶原酶消化后采用两次percoll梯度离心获取卵泡膜细胞.利用波形蛋白、角蛋白、因子Ⅷ三种蛋白的抗体进行细胞免疫荧光染色鉴定和流式细胞术鉴定细胞纯度.结果表明:方法A获得的膜细胞存活率及纯度均显著高于方法B和C(92.00%vs.80.33%,85.00%;95.77%vs.87.87%,90.87%)(P<0.05);方法B获得的细胞数显著高于方法A和C(1.06*107vs.0.74*107,0.86*107)(P<0.05),但耗时显著低于方法A和C(236.67min vs.260.00min,268.33min)(P<0.05).结论:方法A可获得较高膜细胞纯度和细胞活力,本实验为进一步研究膜细胞的功能提供了基础.试验三:AMH对卵泡膜细胞上类固醇激素合成酶的影响及机制研究FSH和AMH单独或是共同添加于卵泡膜细胞中48 h后,通过Real-time qPCR发现:在猪卵泡膜细胞中,FSH和AMH无论是单独作用还是联合作用,对LHCGR、STAR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD的表达均无显著影响(P>0.05),但FSH或AMH单独作用能够显著提高STAR mRNA的表达(P<0.05),FSH和AMH共同作用对STAR mRNA的表达水平无显著影响(P>0.05).这表明,FSH和AMH在促进类固醇合成起始过程中可能存在协同作用.LH和AMH单独或共同添加于卵泡膜细胞中48 h后,通过Real-time qPCR发现:在猪卵泡膜细胞中,LH单独作用能够诱导LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA表达水平上调(P<0.05);AMH单独作用对LHCGR、STAR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA表达水平无显著影响(P>0.05);LH和AMH联合作用时,LHCGR、CYP17A1、3β-HSD mRNA表达水平与对照组及AMH单独作用组均无显著差异(P>0.05),但显著低于LH单独作用组的水平(P<0.05),而对STAR、CYP11A1 mRNA表达水平无显著影响(P>0.05).Forskolin和AMH单独或共同添加于卵泡膜细胞中48h后,通过Real-time qPCR发现,在猪卵泡膜细胞中,Forskolin能够显著上调LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA的水平(P<0.05);Forskolin和AMH共同作用也可上调LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA表达水平,且与Forskolin单独作用无显著差异.这表明,在猪卵泡膜细胞上,AMH并不是以cAMP作为通路调控的.通过普通PCR发现,猪卵泡膜细胞上存在AMHR2.在AMHR2被siRNA干扰的膜细胞中添加LH和AMH,通过Real-time qPCR发现:LH能够上调LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA水平(P<0.05);但AMH对LHCGR、STAR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD m RNA水平无显著影响(P>0.05);LH和AMH共同作用时,LHCGR、CYP11A1和CYP17A1 mRNA表达水平均与对照组无显著差异(P>0.05),而3β-HSD mNRA表达水平显著上调(P<0.05).这表明,AMH在卵泡膜细胞上是通过3β-HSD进而调控LH诱导的类固醇合成.综上所述,本研究表明,AMH在猪上的表达模式与其它物种的相似,AMH及AMHR2的表达量与卵泡的生长发育阶段有关.首次发现,猪的卵泡膜细胞上表达AMHR2,并且AMH通过与AMHR2的结合能够调控3β-HSD的表达进而调控LH诱导的类固醇合成.