猪成纤维细胞重编程和可溶性猪源SOX2-11R重组蛋白制备

体细胞核移植(somatic cells nuclear transfer,SCNT)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)和基因编辑等技术的突破与完善,为医学、畜牧业和生物学基础研究等带来了新的曙光.作为一种重要的经济动物,猪在解剖学、生理学等方面比小鼠更接近于人类,正逐渐成为人类异种移植和再生医学研究中理想的生物学模型.自SCNT和i PSCs取得成功以来,它们在猪上均有较大发展,但SCNT还存在效率低和克隆后代死亡率高等问题,而猪iPSCs也存在基因整合等安全性问题.其中,源头细胞作为两种重编程技术中的首个关键步骤,适宜的源头细胞可能为解决重编程中效率和安全等关键问题提供思路.本研究首先建立了猪胚胎成纤维细胞系(porcine embryonic fibroblasts,PEFs)和成年猪耳源成纤维细胞系(adult porcine ear fibroblasts,APEFs);并以PEFs、APEFs、仔猪脂肪干细胞系(adipose-derived stem cells,ADSCs)为供体细胞进行SCNT,探讨对重构胚胎发育能力的影响;其次,利用多西环素(DOX)诱导的慢病毒系统将PEFs、APEFs和ADSCs重编程为iPSCs,并对各自的重编程效率进行对比分析.旨在借助SCNT和i PSCs两种经典的细胞重编程方法,综合考虑各因素,优选出供体细胞及其重编程方案;最后,通过原核表达的方法制备具有穿透细胞膜功能的可溶性的EGFP-11R和SOX2-11R重组蛋白,以期为制备其它重组蛋白和以蛋白诱导获取无基因整合的iPSCs奠定基础.具体试验及结果如下:试验一成纤维细胞建系和SCNT-通过酶消化、倒置贴壁培养和尼龙网过滤等方法,本实验室成功构建了PEFs,APEFs和ADSCs三株细胞系.在取材方面,因APEFs来自成年公猪耳缘皮肤组织,取材方便、成本低,在动物良种资源保护上具有很大的实际应用价值;ADSCs取自于仔猪背部皮下组织,操作复杂;而PEFs取自于健康怀孕母猪的胎儿,取材和操作繁琐、成本高.在增殖和细胞状态方面,发现增殖数率由高到低依次为ADSCs,PEFs和APEFs;ADSCs和PEFs折光性好、形态饱满,APEFs状态则略差.在作为供体细胞支持重构胚发育方面,以囊胚率做为指标,发现ADSCs和PEFs显著高于APEFs(P<0.05).在重构胚质量方面,以囊胚总细胞数为指标,发现PEFs源重构胚的质量显著优于APEFs(P<0.05).试验二成纤维细胞与ADSCs源猪iPSCs建系-通过DOX诱导的慢病毒系统,成功使三种细胞发生了重编程过程,且都能观察到AP阳性克隆.通过对接种细胞数和克隆总数的统计分析,发现猪ADSCs的重编程效率高于其它两株成纤维细胞系,与SCNT结果一致.在PEFs源i PSCs的建立过程中,先后观察到两类克隆,这证明重编程是一个逐渐缓慢的过程,持续的单克隆传代可能有利于重编程程度的提高.PEFs源iPSCs表现为AP阳性,且在体外培养时无需额外添加药物DOX;在mRNA水平上,外源性OCT4,SOX2,KLF4和C-MYC表达显著高于源头细胞,且内源性OCT4,SOX2,KLF4和C-MYC也得到了激活,OCT4和SOX2表现尤为明显.在蛋白水平上,该株iPSCs表达OCT4和NANOG蛋白.在分化潜能方面,体外能形成拟胚体,形成效率在3%左右.通过逆转录PCR发现,外源性基因OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC已整合到细胞基因组.试验三可溶性EGFP-11R和SOX2-11R重组蛋白的制备-依次通过载体构建、蛋白表达条件摸索和纯化、蛋白鉴定与转导入细胞等步骤,在大肠杆菌提取物的上清中成功获取且纯化出了EGFP-11R和SOX2-11R重组蛋白,且验证其都具有穿透细胞膜能力.其中,可溶性EGFP-11R重组蛋白的最佳表达条件为37℃和0.5 mol/L IPTG诱导4h,而可溶性SOX2-11R重组蛋白的最佳表达条件为28℃和0.5 mol/L IPTG诱导4h.综上所述,本研究首先建立了PEFs和APEFs细胞系,发现APEFs在取材、建细胞系成本、动物福利和良种资源保护方面要优于PEFs和ADSCs.然后,同ADSCs一起对三者的重构胚胎发育能力进行检测,发现在以囊胚率为指标的重构胚发育方面ADSCs和PEFs要优于APEFs,在囊胚质量方面,发现PEFs源囊胚的总细胞数要高于APEFs源囊胚.此外,利用iPSCs技术对三种细胞的重编程潜能进行了再次检测,发现ADSCs显著高于PEFs和APEFs,而PEFs和APEFs间差异不显著,这与SCNT的结果相符;然而,建立的PEFs源iPSCs存在基因整合,限制了其进一步应用.最后,利用原核表达系统制备了在上清中表达且纯化、具有穿透细胞膜功能的EGFP-11R重组蛋白和SOX2-11R重组蛋白,为利用蛋白制备无基因整合的猪iPSCs奠定了基础.