三角帆蚌3个免疫相关基因的分子特征及表达分析
Molecular Characterization And Expression Analysis of Three Related Immune Genes from Hyriopsis Cumingii
本研究以三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)为研究对象,根据构建的三角帆蚌外套膜转录组文库中已标注的EST序列,应用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了热休克蛋白90基因(HcHSP90)、活化的蛋白激酶C1基因(HcRACK1)和富含亮氨酸重复序列基因(HcLRR)的cDNA序列全长,对其进行了生物信息学分析,并分析了三个基因的组织表达及在不同应激条件下应激后不同时间点的表达.结果如下:1.HcHSP90基因的分子特征及表达分析HcHSP90基因cDNA全长为2659bp(GenBank登录号:KR633143),开放阅读框(ORF)为2187bp,另外其5'-和3'-非翻译区长度分别为101bp和371bp,其中3'非翻译区具有AATAAA mRNA加尾信号及Poly(A)寡聚腺苷酸.开放阅读框编码728个氨基酸,蛋白分子量为83.7Ku,等电点为5.13.序列中不存在信号肽和跨膜结构.氨基酸序列分析表明,HcHSP90含有HSP90家族5个保守的序列标签.同源比对分析显示,该基因编码的蛋白与褶纹冠蚌(Cristaria plicata)HSP90氨基酸序列的相似度最高,为83.93%.将所得的氨基酸序列与其他物种的HSP90的氨基酸序列进行多重序列比对,并构建系统树,结果显示,本实验克隆所得HcHSP90基因与已发表的几种软体动物HSP90聚为一支.在非胁迫状态下,HSP90基因在各个检测器官(闭壳肌、斧足、肝胰腺、血淋巴、外套膜、鳃、性腺)中均有表达,在肝胰腺中的表达量最高,性腺次之,闭壳肌中表达量最低.在大多数组织中,HSP90 mRNA表达水平与对照组(15℃)相比在不同温度处理(0,5,25,和35°C)均能显著被诱导.闭壳肌和性腺中,HSP90 mRNA表达水平在5℃达到高峰(8.89倍,P<0.01;2.0倍,P<0.01);肝胰腺中,HSP90mRNA在0℃下显著被抑制(0.29倍,P<0.01);其余四种组织检测到HSP90mRNA表达水平均在35℃达到峰值.暴露于不同浓度的重金属镉(50,100,和200μg/L),HSP90 mRNA在血淋巴和鳃的表达水平上调程度不同,但没有明显的剂量依赖性反应.当嗜水气单胞杆菌侵染后,血淋巴中HSP90 mRNA表达上调,感染36h后达到高峰(12.14倍,P<0.01),在鳃中,感染3h后表达显著上调(3.24倍,P<0.01),然后保持恒定,直到感染36h后恢复至感染前表达水平.2.HcRACK1基因的分子特征及表达分析HcRACK1基因cDNA全长为1249 bp,其中开放阅读框957 bp,编码318个氨基酸.蛋白质结构域分析显示HcRACK1含有RACK1家族特有的7个WD40结构域.运用荧光定量PCR技术分析HcRACK1在非胁迫状态下及受到嗜水气单胞菌侵染和重金属镉暴露后相关组织表达量的变化.结果显示,HcRACK1在各个组织中均有表达,其中闭壳肌中表达量最高;嗜水气单胞菌侵染后,HcRACK1在血淋巴中的表达量逐渐上升,24 h时达到峰值,随后下降;暴露在100μg/L浓度的重金属镉中,HcRACK1在肝胰腺中的表达量逐渐上升,在第3d达到峰值;血淋巴在第2d达到峰值,随后下降;鳃中HcRACK1的表达量无明显变化.3.HcLRR基因的分子特征及表达分析HcLRR基因cDNA全长为3492 bp,其中开放阅读框2142 bp,编码713个氨基酸,包含一段由25个氨基酸组成的信号肽和688个氨基酸组成的成熟肽,氨基酸序列分析显示该序列存在跨膜结构,运用荧光定量PCR技术分析LRR在正常组织中及受到嗜水气单胞菌侵染后相关组织表达量的变化.结果显示,在非胁迫状态下,LRR基因在斧足中表达量最高,在其他组织中几乎不表达.嗜水气单胞菌刺激侵染后可以看到斧足和肝胰腺中LRR基因表达显著下调,而其他组织表达量在不同时间点均出现表达峰值,显示能显著被诱导.
- 作者：
- 王俊南
- 学位授予单位：
- 上海海洋大学
- 专业名称：
- 渔业
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2016年
- 导师姓名：
- 汪桂玲；李家乐
- 中图分类号：
- S917.4
- 关键词：
- 三角帆蚌；免疫基因；克隆；RT-PCR；表达分析
- Hyriopsis cumingii; immune gene; cloning; Real Time-PCR; quantitative analysis;