凡纳滨对虾防病益生菌的筛选和效果评价
Screening and Evalution of Potential Probiotics against Disease in Litopenaenaeus vannamei
第一部分:水产动物防病益生菌的筛选和应用概述随着规模化、集约化水产养殖业的迅速发展,养殖病害也频繁发生.近年来,人们开始尝试在养殖生产中使用有益微生物来改善养殖生态环境,抑制病原微生物,从而减少疾病的发生.本部分对益生菌的定义和常用种类作了概述,介绍了对虾防病益生菌常用的筛选方法和菌株鉴定方法,在益生菌的效果评价方面从促进对虾生长、改善水质、增强虾体免疫力和抑制病原微生物四个方面着重作了介绍,最后结合上述方面论述了对虾防病益生菌筛选中存在的问题和发展前景.第二部分:一株特殊的副溶血弧菌(VPAHPND)拮抗菌的筛选和鉴定从凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)肠道内共分离出244株细菌,以携带毒力基因PirA和PirB的副溶血弧菌为病原菌,采用点种法和滤纸片法筛选对这株副溶血弧菌有拮抗作用的细菌.实验结果表明,m8和a22两菌株均表现出来对VPAHPND较好的拮抗活性,其抑菌圈直径分别为9.33±0.61 mm和4.33±0.11 mm.通过形态学特征、生理生化法和16S rRNA等鉴定方法,m8和a22两菌株均被鉴定为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas).血平板结果表明两菌株都没有溶血活性,这表明,两菌株水产养殖中均可作为安全使用的益生菌,可以作为控制急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)的一种有效手段.第三部分:饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾抗病力及免疫活性的影响将两种拮抗效果较好的菌株m8和a22加到凡纳滨对虾的饲料中,按照添加菌株的不同将凡纳滨对虾分成四组,每组4个重复,每个重复为25只虾.A组(添加106CFU/mL的m8菌株);B组(添加106 CFU/mL的a22菌株)C组(添加106 CFU/m L的m8和a22的混合菌株);D组(不添加益生菌的对照组).养殖实验共持续28天,养殖期间的细菌学分析结果表明,添加益生菌对凡纳滨对虾肠道内细菌总数并无显著影响,但实验组A组和B组的对虾肠道内弧菌总数却显著低于对照组;养殖实验结束后,进行VPAHPND的感染实验,实验结果表明,A组和B组对虾的最终累计死亡率分别为30.0%±0.18和68.3%±0.03,显著低于对照组95.0%±0.15的死亡率(P<0.05).qPCR的分析结果表明感染弧菌后对虾鳃组织中的毒力质粒在8.43±3.10*101--6.63±0.83*103 copies perμg DNA之间.第四部分:养殖水体中添加蜡样芽孢杆菌PC465对凡纳滨对虾抗病力的影响将蜡样芽胞杆菌PC465添加到凡纳滨对虾养殖水体中至终浓度分别为104CFU/mL、105CFU/m L和106 CFU/m L,以无益生菌添加的养殖组为对照组,定期检测实验对虾肠道和养殖水体中的细菌总数、弧菌总数以及水体中氨氮含量、亚硝酸氮含量.实验结果表明:水体中添加益生菌能降低凡纳滨对虾肠道内细菌数量;高浓度的益生菌处理组可以明显降低养殖水体内弧菌数量(P<0.05),但是益生菌并没有显著影响水体中的氨氮含量和亚硝酸氮含量.养殖4周后进行WSSV投喂感染实验,感染实验表明,H组(益生菌浓度为106CFU/mL)和M组(益生菌浓度为105CFU/m L)凡纳滨对虾的累计死亡率分别为63.9%和74.6%,显著低于对照组100%的累计死亡率(P<0.05).感染实验期间采用qPCR方法测定了凡纳滨对虾3种免疫相关基因的表达情况,数据显示,益生菌处理组的脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白(Lipopolysaccharideaβ-1,3-glucan-binding protein,LGBP),β-1,3-葡聚糖结合蛋白-脂蛋白(beta-1,3-glucan-binding protein-Lipoprotein,βGBP-HDL),热激蛋白70(Heat shock proteins,Hsp70)的mRNA的表达量在WSSV感染后呈显著上调趋势.实验结果提示:水体中添加蜡样芽孢杆菌PC465可以提高凡纳滨对虾抗WSSV感染能力,其对凡纳滨对虾抗病力的提高可能是通过降低对虾肠道和水体中的细菌和弧菌数量以及调节免疫相关基因的表达水平来实现的.
- 作者：
- 王春迪
- 学位授予单位：
- 上海海洋大学
- 专业名称：
- 渔业
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2016年
- 导师姓名：
- 宋晓玲
- 中图分类号：
- S945.49；S917.1
- 关键词：
- 凡纳滨对虾；益生菌；抗病性；肠道菌群；免疫效果
- Litopenaeus vannamei; probiotics; disease resistance; intestinal flora; immune effects;