三角帆蚌SPI和LBP/BPI基因的分子特征、表达分析及SNP的应用研究
Molecular Characterization,Expression Analysis And SNP Application Analysis of SPI And LBP/BPI Genes from Hyriopsis Cumingii

在我国的淡水珍珠养殖中,三角帆蚌占有很大的比重,具有重要的经济地位.近年来在珍珠养殖中病害越来越多,对三角帆蚌良种的需求也越来越严峻,本实验在已建立的三角帆蚌cDNA文库的基础上对免疫相关基因:Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子(Kazal-type serines proteinase inhibitor,KSPI)基因、Kuntiz型丝氨酸蛋白酶抑制因子(Kuntiz-type serines proteinase inhibitor,KuSPI)基因和脂多糖结合蛋白/杀菌通透性增加蛋白(LPS-binding protein/Bactericidal Permeability Increasing protein,LBP/BPI)基因的cDNA全序列进行了Race克隆并对其序列和氨基酸序列进行了分析,利用荧光定量方法对三个基因进行了表达分析.同时,通过PCR方法对KSPI基因的内含子进行了扩增,通过直接测序法在两个三角帆蚌群体(抗性群体和易感群体)中筛选出KSPI基因的SNP(single nucleotide polymorphism)位点,并对其SNP位点的基因型和等位基因频率在各群体中的遗传分布进行研究,以获得与抗性性状相关的SNPs位点,为三角帆蚌遗传育种研究提供新的分子标记.主要研究结果如下:1.三角帆蚌2个丝氨酸蛋白酶抑制因子基因cDNA全序列的克隆、分子特征及表达分析KSPI基因与KuSPI基因同属于丝氨酸蛋白酶抑制因子基因,通过Race克隆技术获得KSPI基因cDNA全序列1029 bp,其中包含5'、3'端非翻译区分别为61bp、206bp,开放阅读框762bp,共编码氨基酸253个,具有27397.5u的分子量;KuSPI基因cDNA全序列为624 bp,其中包含5'、3'端非翻译区分别为38bp、148bp,开放阅读框438bp,共编码氨基酸145个,具有16397.5u的分子量.通过与已知物种的丝氨酸蛋白酶抑制因子的进行氨基酸序列比对发现,KSPI含有5个典型Kazal结构域,KuSPI氨基酸序列包含1个典型Kutiz结构域,氨基酸序列包含5个Kazal结构域,是丝氨酸蛋白酶抑制因子特有的结构域,属于典型的丝氨酸蛋白酶抑制因子基因,另外两个基因都具有明显的跨膜结构,都属于分泌蛋白,这与其主要的生物学功能相符.通过实时荧光定量发现,在正常组织中,kspi基因和kuspi基因在三角帆蚌均在外套膜、血液、肝、腮、闭壳肌、性腺、斧足、肠、肾脏9个组织中均具有一定的表达量.其中kuspi基因主要在外套膜中表达,其它组织表达量很低,而kspi基因除了外套膜表达量最高外,在闭壳肌中也具有较高的表达量.利用嗜水气单胞菌进行诱导后发现,kspi在血液、外套膜、性腺等多个组织中均发生明显变化,呈现出先升高再降低的趋势,在12或24小时达到最大值,之后开始逐渐下降并趋于稳定;对于kuspi基因,表达量发生变化最大的组织是外套膜,呈现明显出先升高再降低的趋势,在6小时达到最大值,之后开始逐渐下降并趋于稳定,而在其它组织中变化不明显.由此结果可以看出,kspi基因和kuspi基因在外套膜中发挥作用最大,kspi在各个组织中的分布比kuspi更为广泛,推测可能由于kspi较kuspi有更多的结构域,能更好的发挥其丝氨酸蛋白酶抑制因子的作用.2.三角帆蚌lbp/bpi基因cdna全序列的克隆、分子特征及表达分析通过race克隆技术,获得了三角帆蚌lbp/bpi基因的cdna全长1825bp,其中包含5'、3'端非翻译区分别为97bp、219bp,开放阅读框1509bp,共编码氨基酸502个,具有56478.5u的分子量,氨基酸序列包含bpi1和bpi2两个结构域,与一些已知物种的bpi基因氨基酸序列进行同源性分析后发现,与各种物种间具有相似的结构域,属于典型的bpi基因.实时荧光定量pcr分析结果表明:lbp/bpi基因在外套膜、血液、肝、腮、闭壳肌、性腺、斧足、肠、肾脏9个组织中均存在一定的表达量,表达量最高的是血液,表达量最低的是斧足.利用嗜水气单胞菌诱导后检测发现,变化最明显的是血液,呈现明显出先升高再降低的趋势,在12小时达到最大值,之后开始逐渐下降并趋于稳定,推测出lbp/bpi基因对三角帆蚌的免疫反应发挥重要作用.3.三角帆蚌kspi基因内含子扩增及抗性群体和易感群体的snp分析通过pcr方法从三角帆蚌dna中扩增出kspi基因的内含子序列,kspi基因全长为4749bp,含有5个外显子,4个内含子,其中外显子Ⅰ110bp,外显子Ⅱ94bp,外显子Ⅲ132bp,外显子Ⅳ275bp,外显子Ⅴ420bp,内含子Ⅰ长度为521bp,内含子Ⅱ长度为1990bp,内含子Ⅲ长度为436bp,内含子Ⅳ长度为739bp.以三角帆蚌抗性群体和易感群体为研究对象,通过直接测序法筛选snps位点.在kspi基因中共获得了23个snp位点,并研究这些多态性位点与抗逆性状的相关性.其中内含子区的-1882g-a位点、-3694a-c位点、-3793a-c位点、-4119t-a位点、-4199c-t位点、-1291g-c位点、-4114a-g位点以及外显子区的-2812g-t位点的基因型频率和等位基因频率在抗性和易感群体中均存在显著性差异(P<0.05).