虾夷扇贝毒素暴露对栉孔扇贝MXR相关蛋白活性和表达影响的初步研究

虾夷扇贝毒素及其衍生物(yessotoxins,YTXs)是一类含有2个磺酰基的脂溶性多环聚醚类化合物,主要由网状原角藻(Protoceratium reticulatum)、多边舌甲藻(Lingulodinium polyedrum)和具刺膝沟藻(Gonyaulax spinifera)产生,能在贝类等海产品体内累积并沿食物链传递,对人类健康造成威胁.本研究选取新近分离自我国北黄海海域的网状原角藻,在研究温度和不同氮磷比对该藻生长和产毒影响的基础上,以栉孔扇贝(Chlamys farreri)为受试对象,进行YTX毒素短期暴露实验,通过液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)检测方法、罗丹明B(rhodamine B,Rho B)外排法、免疫组织化学方法分别对栉孔扇贝鳃和消化腺中YTX毒素累积变化情况,与多型异源物质抗性(multi-xentiobiotic resistance,MXR)密切相关的蛋白-P糖蛋白(p-glycoprotein,P-gp)的转运活性及在两种组织中的定位进行了研究;采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)等分子生物学方法对YTX暴露情况下P-gp及其他三种与毒素转运和解毒相关蛋白(酶)多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP)、细胞色素酶3A(cytochrome P450 3A-like proteins,CYP3A)和谷胱甘肽硫转移酶ω亚族(glutathione-S-transferase omega class,GST-ω)在栉孔扇贝鳃和消化腺中m RNA的表达变化进行研究,分析探讨四种蛋白(酶)在扇贝抵抗或耐受YTX毒素中可能的作用机制.研究结果如下:(1)重要环境因子-温度和氮磷比对网状原角藻生长和产毒的影响研究结果表明,低温更适宜该藻生长,15℃时L1-Si培养基中藻细胞生长最好,指数生长期比生长速率达到0.34/d.光镜下观察到,N、P限制分别导致静止期藻细胞的不规则变形和体积变大,且该变化与温度无关.高效液相色谱质谱联用(HPLC–MS/MS)分析表明,YTX为该藻株主要毒素产物;N、P限制均有利于胞内毒素含量的升高,15℃时1/10P培养基中单个藻细胞中YTX含量最高,达到92.6 pg/cell,分别是1/10N和L1-Si培养基中藻细胞毒素含量的3.8倍和7.1倍;1/10N培养基条件下,在5℃-15℃范围内,藻细胞中YTX含量随温度升高逐渐下降,1/10P培养基条件下反之.(2)YTX诱导的栉孔扇贝组织中P糖蛋白转运活性变化及其免疫定位罗丹明B外排实验表明YTX毒素暴露能显著增强鳃和消化腺中P-gp转运活性,暴露12 h后鳃和消化腺Rho B的排出速率就已分别达到对照组的3.8倍和1.4倍,随着暴露时间的延长,P-gp活性略有增强,72 h后开始下降;P-gp的功能性抑制剂维拉帕米(verapamil,VRP)在实验设定的浓度下没有抑制反而增强了Rho B的外排;免疫定位显示,毒素暴露后鳃丝前端纤毛柱状细胞及消化腺导管上皮柱状细胞和腺管消化细胞P-gp免疫阳性信号增强,说明YTX毒素暴露提高了P-gp的表达量.(3)栉孔扇贝组织P糖蛋白及其他与MXR相关的解毒蛋白基因表达变化的研究实时荧光定量PCR检测发现,YTX暴露使得栉孔扇贝鳃和消化腺P-gp基因表达均显著上调;鳃组织中GST-ω和MRP基因表达水平也明显升高,增幅分别为对照组的8.3倍和4.5倍;鳃中CYP3A和消化腺中GST-ω、MRP基因表达虽有增加但不显著;消化腺中CYP3A基因表达则受到YTX的明显抑制,表达量仅为未染毒时的一半.这表明,四种基因均参与了栉孔扇贝的解毒过程,但在解毒或抗YTX毒性中发挥的作用不同.随时间延长鳃和消化腺中基因表达量均逐渐降低,染毒72 h后鳃MRP以及消化腺GST-ω和P-gp的基因表达下降明显,这可能与YTX的大量累积或组织受到损伤有关.综上推断,温度和氮磷比对网状原角藻(北黄海株)生长和产毒均有影响,但氮磷比的影响更显著.15℃时L1-Si培养基最有利于该藻细胞生长,1/10P培养基藻细胞产毒能力最强.YTX可能是P-gp的底物,能够诱导P-gp转运活性增强,并通过增加P-gp基因和蛋白表达来参与栉孔扇贝对YTX毒素的耐受或抗性.因此,P-gp是参与栉孔扇贝解毒的重要蛋白,可作为检测水环境中YTX含量的生物标志物,为有效降低该毒素带来的损失提供依据.代谢酶CYP3A和GST-ω及转运蛋白MRP也参加了栉孔扇贝对YTX的解毒过程,但其在栉孔扇贝对YTX的解毒过程中发挥的作用还有待进一步研究.