近海沉积物、悬浮颗粒物中脂溶性藻毒素检测及藻体中毒素的纯化

近十年来,海洋环境中的脂溶性藻毒素由于种类多、分布广、影响大,逐渐成为环境化学家研究的热点;然而,目前对海洋沉积物和悬浮颗粒物中脂溶性藻毒素的研究相对较少,缺乏有效的检测方法.而对沉积物和悬浮颗粒物中脂溶性藻毒素的测定,对阐明海洋环境中脂溶性藻毒素的赋存状态,揭示其环境行为具有重要意义.高纯度毒素对照品是化学法检测毒素的必需品,此外,开展毒素环境化学行为、毒性效应等相关研究也需要纯度较高的毒素,因此,典型毒素纯化技术的研究成为科研工作者亟待解决的难题.本研究发展了高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术检测海洋沉积物和悬浮颗粒物中多种脂溶性藻毒素的方法,并对方法进行了应用;此外,以实验室内培养的利玛原甲藻为原料,对高速逆流色谱-质谱(HSCCC-MS)联用技术纯化3种典型脂溶性藻毒素的可行性进行了研究;具体内容如下:1.发展了一种适用于海洋沉积物中7种典型脂溶性藻毒素同步检测的方法,并将该方法用于杭州湾、胶州湾以及莱州湾海域沉积物中脂溶性藻毒素的检测.采用加速溶剂萃取法(ASE)对沉积物中的脂溶性藻毒素进行萃取,并对萃取条件进行了系统优化;采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-ESI-MS2)多反应离子监测(MRM)模式,对包括:大田软海绵酸(OA)、虾夷扇贝毒素(YTX)、鳍藻毒素-1(DTX1)、罗环内酯毒素-1(SPX1)、原多甲藻酸-1(AZA1)、原多甲藻酸-2(AZA2)、扇贝毒素-2(PTX2)在内的7种脂溶性藻毒素进行检测,采用基质匹配标准曲线-外标法对目标化合物进行定量,以消除沉积物基质的影响.实验结果表明,ASE法对沉积物中的7种脂溶性藻毒素萃取率高,检测方法的专属性强,精密度(RSD≤8.75%)、重复性(RSD≤14.76%)和稳定性(RSD≤17.37%)良好;7种目标化合物的检出限介于34.4 pg/g-618.5 pg/g之间,回收率在78.0%-109.0%之间,表明方法的灵敏度和准确度较好,能满足海洋沉积物中7种脂溶性藻毒素同步检测的要求.采用该方法从杭州湾、胶州湾以及莱州湾海域沉积物中检出不同浓度的OA和PTX2:杭州湾样品中主要检出OA,其浓度从186.0到280.7 pg/g;莱州湾的沉积物样品中主要检出PTX2,其浓度从256.4到944.9 pg/g;胶州湾的沉积物样品中检出OA和PTX2,但其浓度均低于定量限;检测结果表明杭州湾、莱州湾和胶州湾的沉积物都受到一定程度的脂溶性藻毒素污染.2.建立了海水悬浮颗粒物中8种典型脂溶性藻毒素同步测定的超高效液相色谱-电喷雾串联质谱(UPLC-ESI-MS2)联用分析方法.海水悬浮颗粒物样品经甲醇超声辅助提取后,以5 mmoL/L乙酸铵水和乙腈为流动相,经亚2微米C18色谱柱分离,采用电喷雾串联质谱(ESI-MS2)多反应监测(MRM)模式检测,外标法定量.结果表明,在最佳实验条件下,包括:OA、YTX、DTX1、SPX1、AZA1、AZA2、PTX2、米氏裸甲藻毒素(GYM)8种目标物在5 min内分离良好,加标回收率在83.8%-98.3%之间,并且方法具有良好的重复性(相对标准偏差(RSD)≤14.13%)和灵敏度(检出限介于2.9-103.1 pg/g之间),在线性范围内相关系数(R2)均大于0.996,能满足海水悬浮颗粒物中8种脂溶性藻毒素同步检测的要求.采用本方法初步分析了青岛沿岸海域海水悬浮颗粒物中的脂溶性藻毒素,其中PTX2在石老人和第三海水浴场被检出,含量分别为717.2和790.6 pg/g(干重).3.采用高速逆流色谱-质谱(HSCCC-MS)联用技术,结合大孔吸附树脂和半制备HPLC纯化技术,发展了以利玛原甲藻为原料分离、纯化3种脂溶性藻毒素的新方法.利玛原甲藻干藻粉中3种脂溶性藻毒素经90%甲醇水溶液超声提取后,利用大孔吸附树脂法进行初步纯化;随后对HSCCC分离条件进行系统优化,采用最佳HSCCC分离条件对经大孔吸附树脂初步纯化后的毒素粗提物进行分离,最后利用半制备HPLC对3种毒素分别进一步纯化.结果表明,HSCCC分离的最佳溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-1%甲酸水溶液(1∶1.75∶1.2∶1,V/V),该方法具有良好的重复性和稳定性,单次可实现150 mg毒素粗提物样品的分离,经其分离后,OA的纯度为89%,化合物816的纯度为86%,DTX1的纯度为83%;通过半制备HPLC对3种毒素的进一步纯化,可以将3种毒素的纯度提高到99%以上;纯化后的毒素在酸性溶液中易发生结构异化,而以干粉形式在低温条件下保存较为稳定.