雷帕霉素诱导自噬对吸烟和D-半乳糖致器官损伤的保护作用

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是细胞内一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其在体内主要以mTORC1和mTORC2两种形式存在,调控蛋白质合成、脂肪生成、能量代谢、自噬及细胞骨架等,广泛参与了机体生长、发育、衰老、代谢、免疫、肿瘤发生等过程.课题组前期的体外实验证实,激活自噬可明显减缓过氧化氢诱导的细胞老化;抑制自噬增加了成纤维细胞中p53、p21等细胞周期相关蛋白的表达,诱导细胞生长停止和衰老,提示自噬参与了细胞衰老的过程,但mTOR调节衰老性器官损伤是否与自噬活性相关,目前尚不清楚.雷帕霉素作为首个已知的mTOR抑制剂,目前在临床上主要作为免疫抑制剂用于器官移植后排斥反应和自身免疫性疾病的治疗.为进一步扩大雷帕霉素的临床适应症,本研究拟采用氧化应激诱导器官衰老性损伤、记忆力减退模型,探讨雷帕霉素的保护作用.目的:研究雷帕霉素(Rapamycin,Rap)对吸烟、D-半乳糖致氧化应激诱导靶器官损伤是否具有保护作用,并探讨其机制是否与自噬水平相关.方法:70只雄性昆明种小鼠(体重20-22g)适应性喂养1周后随机分为7组,每组10只.A组为正常对照(Control)组;B组为吸烟(Smoking)组,小鼠每天被动吸烟4次,每次20分钟,每周6天,连续吸烟8周;C组为吸烟+雷帕霉素(Smoking+Rap)组,小鼠在吸烟第5周开始同时腹腔注射Rap(2mg/kg/d),连续给药4周;D组为吸烟+氯喹(Smoking+CQ)组,小鼠在吸烟第5周开始同时腹腔注射CQ(50mg/kg/d),连续给药4周;E组为D-半乳糖(D-Gal)组,小鼠每天用颈背部皮下注射D-半乳糖(80mg/kg/d)诱导衰老,连续给药8周;F组为D-半乳糖+雷帕霉素(D-Gal+Rap)组,小鼠在给D-半乳糖第5周开始同时腹腔注射Rap(2mg/kg/d),连续给药4周;G组为D-半乳糖+氯喹(D-Gal+CQ)组,小鼠在给D-半乳糖第5周开始同时腹腔注射CQ(50mg/kg/d),连续给药4周.实验结束后A、E、F、G组小鼠进行为期6天的morris水迷宫实验,检测小鼠的学习记忆能力.然后处死动物,取部分心脏、脑、肺组织于-80℃超低温冰箱冻存;另取部分组织于甲醛溶液中固定,用苏木素-伊红(he)染色法观察小鼠心脏、脑、肺组织的形态学改变情况.用黄嘌呤氧化酶法测定心脏、脑、肺组织超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)的活力;硫代巴比妥酸法测定每组小鼠心脏、脑、肺组织的丙二醛(malondialdehyde,mda)的含量;蛋白质印迹法(westernblot)检测心脏、脑、肺组织中p62蛋白的表达水平.结果:1.morris水迷宫检测发现,随着训练时间、次数的增加,d-gal组与control组相比,小鼠找到平台的平均逃避潜伏期明显延长;撤出平台后,小鼠穿越原平台位置的次数明显减少(p<0.05),提示d-半乳糖诱导了小鼠学习记忆减退.与d-gal组相比,自噬抑制剂氯喹干预后这种记忆衰退情况更加严重,但结果无统计学差异,而预先给予雷帕霉素干预可显著改善d-半乳糖所致学习记忆和空间记忆的减退(p<0.05).2.光镜下control组小鼠心肌组织排列整齐均匀,smoking组和d-gal模型组出现组织细胞间空隙变大,炎症细胞变多;给予氯喹干预后心肌细胞间间隙变得模糊,炎症细胞更加明显,而雷帕霉素干预后这种现象有所好转,提示雷帕霉素对吸烟、d-半乳糖致心肌损伤小鼠具有一定的保护作用;control组小鼠海马神经元染色均匀,排列整齐;smoking组和d-gal组出现神经元缺失,部分神经元形态异常,排列紊乱,细胞变细、变长,胞体及胞核变小、皱缩,显示明显的变性样改变;氯喹干预后神经元缺失等现象更加严重,而预先给予雷帕霉素干预可明显改善神经元排列紊乱、缺失等现象.control组小鼠肺组织结构清晰,肺泡完整,肺泡腔无渗出,肺间隔正常;smoking组和d-gal模型组肺组织结构紊乱、肺泡萎缩塌陷,肺泡壁增厚结构缺失,炎细胞浸润;给予氯喹干预后肺组织结构更加紊乱,炎细胞数量更多,而雷帕霉素干预后肺组织结构紊乱现象明显好转,炎细胞数量也相对变少.3.与control组相比,smoking和d-gal模型组小鼠肺、心脏、脑组织中mda含量显著增加,sod活力明显降低,p62蛋白的表达水平显著增强(p<0.05);氯喹干预后,mda含量进一步增加(p<0.05),sod活力进一步降低(p<0.05),p62蛋白的表达明显增强(P<0.05);预先给予雷帕霉素干预可显著降低吸烟和D-半乳糖诱导的MDA含量增加(P<0.05),升高SOD活力(P<0.05),降低p62蛋白的表达水平(P<0.05).结论:雷帕霉素可明显改善D-半乳糖皮下注射所致脑损伤小鼠的学习记忆能力的衰退,减轻被动吸烟和D-半乳糖注射引起的小鼠心、脑、肺组织的氧化损伤,机制可能是与其阻断mTOR信号通路,增加细胞自噬活性相关.