根癌农杆菌介导转化筛选漆酶高产突变株
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,由于自身特殊的催化性质,在造纸工业、食品工业、生物合成领域和生物修复等方面具有巨大的应用潜力.平菇(Pleurotus ostreatus)学名侧耳,是一种白腐真菌,可以合成包括漆酶在内的多种木质纤维素降解酶,是目前研究较多的漆酶产生菌之一.随着分子生物学的发展,利用基因工程技术对目标菌株进行基因改造,以满足工农业生产的需求,成为现代生物技术研究和应用的重要手段.本文利用根癌农杆菌介导转化的方法构建突变株,筛选漆酶高产菌,为提高漆酶的产量奠定基础.对不同来源平菇菌株的漆酶合成能力进行比较分析,结果显示,在普通PDA培养基中4种菌株的漆酶活性基本无差异,但在培养基中添加铜离子和酵母粉两种诱导物质后,发酵液中的漆酶活性出现差异,添加铜离子对平菇5号的诱导作用最强,在培养至第6天,漆酶活性达329.78U/mL,酵母粉对平菇4号和平菇5号均具有较强的诱导作用,发酵液中漆酶活性最大值分别为613.98 U/mL和783.61U/mL.综合考虑漆酶活性以及菌体生长等因素,选择平菇5号作为出发菌株.目前利用农杆菌介导转化大型真菌均以子实体菌褶为受体,但子实体存在取材受时间限制较大的问题,栽培周期长,管理费时.因此我们尝试建立一种以菌丝体为受体的遗传转化方法----嵌套平板法.此方法操作简单,周期短,可获得转化子.对遗传转化条件的优化结果为:根癌农杆菌菌液的最适浓度OD600=0.6~0.7,诱导培养基中添加200 μmol/L AS,25℃共培养3-5 d.通过根癌农杆菌介导转化法对平菇菌丝进行遗传转化,得到了大量的转化子.利用漆酶与ABTS反应显色的方法进行初筛,再通过摇瓶复筛得到4株突变株.在液体培养条件下,对4株突变株产漆酶能力进行比较分析.结果显示,与出发菌株相比,在普通PDA培养基中,4株突变株漆酶合成量均有不同程度的增加,其中突4和突6漆酶合成量增加幅度较大,漆酶合成量达到对照的2倍.在培养基中添加1 mmol/L铜离子,突7漆酶活性增加较大,在培养第16天漆酶活性达到1004.17 U/mL,是单一PDA中漆酶活性的13倍.酵母粉对突2和突6的诱导作用较强,发酵液中漆酶活性的最大值分别为1022.22 U/mL和1062.5 U/mL,较单一PDA培养基漆酶活性上升了13和10倍.
- 作者：
- 黄顺
- 学位授予单位：
- 安徽科技学院
- 专业名称：
- 农业推广(专业学位)
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2016年
- 导师姓名：
- 祝嫦巍；于力
- 中图分类号：
- Q93
- 关键词：
- 根癌农杆菌介导法；平菇；漆酶；优化；筛选
- Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation； Pleurotus ostreatus； laccase； optimization； screening
- 基金项目：
- 安徽省自然科学%国家自然科学