棒形杆菌属及短小杆菌属DNA条形码筛选及应用
DNA条形码技术是通过分析一个标准片段的DNA序列,利用序列信息达到物种鉴定目的的分子诊断技术,是分子生物学和生物信息学有机结合的产物.该技术依托成熟的PCR扩增和产物测序技术,同时结合发达的网络信息技术,给我们提供了一种简便,快速,准确的新分类方法.该技术已成为近些年来生物分类学的研究热点,为传统鉴定方法提供了有效补充.主要原理是利用DNA片段物种间的变异高于物种内变异,从而达到区分物种的目的.本文选取植物病原细菌中较为重要的棒形杆菌属与短小杆菌属为研究对象,筛选用于这两个属的DNA条形码基因.为筛选获得棒形杆菌属鉴定用条形码基因,本文选用棒形杆菌属及其相近的菌属共计95个菌株,使用16S rRNA、cpn60、gyrB及rpoD这4个基因进行PCR扩增和测序、比较4个基因序列的扩增率及测序成功率、计算序列的碱基组成及碱基变异频率、对种内种间,亚种内亚种间变异进行对比、采用wilcoxon秩和检验分析比较不同序列间差异、同时对不同序列种内种间变异进行barcoding gap分析、采用NJ法构建系统进化树.结果综合显示gyrB基因是棒形杆菌属理想的条形码基因,它在将棒形杆菌属与其相近属区分的同时能够很好的将棒形杆菌属内的五个亚种区分开来,在几个候选条形码基因里为最优选择.cpn60基因也能达到区分棒形杆菌属内亚种的目的,但其效果亚于gyrB基因,而16S rRNA基因在种水平的区分非常有优势,但不能够很好的区分到亚种,rpoD基因扩增效果不佳故未做后续分析.在对短小杆菌属DNA条形码候选基因的筛选中共选用短小杆菌属及其相近菌属共68个菌株为实验材料,采用16S rRNA、cpn60、gyrB、rpoD 4个基因对其进行PCR扩增和测序、比较各个基因序列的扩增率及测序成功率、计算序列的碱基组成及碱基变异频率、同时对成功获得的基因片断进行组合分析即16S+cpn60,16S+gyrB,cpn60+gyrB,16S+cpn60+gyrB.对3个基因片段及4个片段组合进行种内种间,致病变种内致病变种间遗传变异比较、采用wilcoxon检验来比较分析不同序列及序列组合之间的差异.同时对不同序列及其组合的种内种间变异进行barcoding gap分析、采用NJ法构建系统进化树.结果综合显示3个基因和4个基因片段组合都能够较好的区分到种,但对萎蔫短小杆菌下的4个致病变种不能够很好的区分开来.其致病变种内的遗传变异要大于致病变种间的遗传变异.因此想要将萎蔫短小杆菌种下阶元区分开来,应筛选出致病变种间遗传变异明显大于致病变种内遗传变异的DNA条码基因.本文对疑似棒形杆菌属的燕麦分离物进行DNA条形码方法应用验证,其所得结果与预期相符,证明DNA条形码技术可以在棒形杆菌属内得到较好的应用.同时还对棒形杆菌属内番茄溃疡病的特异性检测引物进行筛选,结果表明PSA8/PSAR这对引物无论是从扩增率或是从特异性方面都是最好的.
- 作者：
- 胡洁
- 学位授予单位：
- 陕西理工学院
- 专业名称：
- 微生物学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2016年
- 导师姓名：
- 解修超；赵文军
- 中图分类号：
- Q78；S432.4
- 关键词：
- 棒形杆菌属；短小杆菌属；DNA条形码；检测；鉴定
- Clavibacter； Curtobacterium； DNA barcodes； detection； identification