野生与养殖大鲵肠道微生物多样性分析及产酶活性研究

大鲵(Andrias davidianus)属两栖纲有尾目隐鳃鲵科,为国家二级保护动物,是两栖纲动物的最大物种,也是动物进化的"活化石".大鲵属肉食性动物,食性主要为蛋白类食物.大鲵的生长发育及摄食种类受季节性影响较大,大鲵是两栖纲与爬行纲的过渡类群,其消化道结构复杂,肠道微生物组成多样.研究大鲵肠道微生物多样性及产酶活性不仅可以给野生大鲵保护提供依据,也可以为大鲵人工化养殖预防病害提供依据.本论文研究以野生大鲵与养殖大鲵两种样品为实验材料,通过微生物纯培养技术与免培养技术全面的分析两类生境下的大鲵肠道微生物的组成与群落多样性分析;通过微生物胞外酶研究方法对两种样品进行肠道细菌产胞外酶筛选.野生大鲵肠道微生物多样性及产酶活性分析采用纯培养技术分离野生大鲵肠道细菌,选用引物27F/1492R扩增后进行分子生物学鉴定.结果表明,野生大鲵分离到的86株肠道细菌可划分为2个门6个属,变形菌门(Proteobacteria,80.23%):罗维登斯菌属,爱德华氏菌属,柠檬酸杆菌属;厚壁菌门(Firmicutes,19.77%):漫游球菌属,芽孢杆菌属,赖氨酸芽孢菌属.应用胞外酶培养基筛选野生大鲵肠道微生物胞外酶活性.结果表明,野生大鲵分离到的86株肠道细菌,产蛋白酶(Proteinase)、淀粉酶(Amylase)、纤维素酶(Cellulase)及脂肪酶(Lipase)菌株依次占总数的96.51%,73.26%,94.19%,5.82%.采用免培养技术提取野生大鲵肠道内容物总DNA,选用引物799F/1492R进行特性扩增后连接至载体并转化,选用质粒引物M13+/M13-筛选,使用限制性核酸内切酶Hae III进行(PCR-RFLP)分析后进行测序,并鉴定到属.结果表明,野生大鲵肠道细菌的101个克隆单元可划分为3个门16个属,变形菌门(Proteobacteria,94.06%):气单胞菌属,不动杆菌属,慢生根瘤菌属,鞘脂单胞菌属,德沃斯氏菌属,假单胞菌属,勒克菌属,拉乌尔菌属,泛菌属,黄色单胞菌属,肠杆菌属;厚壁菌门(Firmicutes,3.96%):梭菌属,枝芽孢杆菌属,芽孢菌属.衣原体门(Chlamydiae,1.98%):嗜衣体属.采用免培养技术提取大鲵肠道总DNA,选用古菌特异性109F/958R和Met86F/Met1340R引物扩增后连接至载体pMD-19T并转化,选用质粒引物M13+/M13-筛选,使用限制性核酸内切酶Afa I进行(PCR-RFLP)分析后进行测序,并鉴定.结果表明,野生大鲵肠道古菌的49个克隆单元可划分为1个门2个纲,广古菌门(Euryarchaeota):热源体纲(Thermoplasmata,12.24%),甲烷菌纲(Methanoplasmatales,4.08%),未分类到纲古菌(Uncultured Archaeon,73.48%).养殖大鲵肠道微生物多样性及产酶活性分析采用纯培养技术分离养殖大鲵肠道细菌,选用引物799F/1492R扩增后进行分子生物学鉴定到属.结果表明,养殖大鲵分离到的97株肠道细菌可分为3个门16个属,变形菌门(Proteobacteria,87.63%):爱德华氏菌属,志贺氏菌属,沙雷氏菌属,埃希氏菌属,沙门氏菌属,肥杆菌属,邻单胞菌属,耶尔辛氏菌属,肠杆菌属,孤菌属,克吕沃氏菌属,克雷伯氏菌属,气单胞菌属,假单胞菌;厚壁菌门(Firmicutes,7.22%):芽孢杆菌属;放线菌门(Actinobacteria,5.15%):短杆菌属.应用胞外酶筛选培养基筛选肠道微生物胞外酶活性.结果表明,养殖大鲵分离到的97株肠道细菌产蛋白酶(Proteinase)、淀粉酶(Amylase)、纤维素酶(Cellulase)菌株占总数的89.69%,73.20%,86.60%.采用免培养技术提取养殖大鲵肠道内容物总DNA,选用引物799F/1492R进行特性扩增后连接至载体并转化,选用质粒引物M13+/M13-筛选并(PCR-RFLP)分析后进行测序,鉴定到属.结果表明,养殖大鲵肠道细菌的105个克隆单元可划分为4个门15个属,变形菌门(Proteobacteria,71.42%):埃希氏菌属,志贺氏菌属,沙雷氏菌属,耶尔辛氏菌属,食碱菌属,沙门氏菌属,哈夫尼菌属,希万氏菌属,布丘氏菌属;厚壁菌门(Firmicutes,7.62%):芽孢杆菌属,葡萄球菌属;放线菌门(Actinobacteria,20.01%):短杆菌属,戈登氏杆菌属,红蝽杆菌属;拟杆菌门(Bacteroidetes,0.95%):理研菌属.