塔里木马鹿茸间充质干细胞软骨诱导分化及c-myc基因的表达
鹿茸在我国中医药典中是珍贵的中医药材,具有较高的经济价值,其快速生长和割后再生的特点是哺乳动物器官中独有的,成为国内外研究的热点.c-myc基因是原癌基因家族中的一种转录因子,研究发现在很多癌症组织中上调表达,对正常组织细胞具有调控增殖、分化和细胞凋亡等多种功能,塔里木马鹿是新疆南部地区重要的经济动物之一,以塔里木马鹿茸为材料研究其间充质干细胞(MSCs)培养模式及细胞的生物学特性,建立鹿茸MSCs体外软骨分化模型为鹿茸生长发育的研究和人类软骨发育及骨疾病研究提供基础;同时研究体外诱导MSCs软骨分化过程中c-myc基因的表达特征,为鹿茸快速生长机制的研究提供理论支持.1、实验利用酶消化法和组织块法相结合成功获得鹿茸MSCs,体外培养的组织块1d贴壁,2 d后有细胞迁出,6 d时细胞数量达到高峰.传代培养的2-6代细胞在培养到4 d时细胞增殖达到高峰.原代培养细胞呈梭形,细胞核呈椭圆形,细胞呈菊花状排列生长;传代细胞形态呈梭形,排列无规则.5%的二甲基亚砜作为冷冻液可将细胞冷冻时间达到30 d以上且不影响其复苏和生长.2、在培养液中加入10 ng/mL TGFβ1、10-7 M地塞米松和50μg/mL抗坏血酸作为诱导培养基,成功体外诱导鹿茸MSCs向软骨分化,结果显示,在诱导第7 d的细胞开始少量表达Ⅱ型胶原基因(Co LⅡ),但是未检测到蛋白的表达.从诱导14 d至21 d细胞CoLⅡ表达量增加,阿利新蓝和甲苯胺蓝染色鉴定蛋白多糖结果逐渐达强阳性.在诱导21 d可获得软骨样细胞,细胞CoLⅡ的表达显著高于其他诱导天数的细胞(p<0.05),免疫组化鉴定胞外Ⅱ型胶原蛋白的量呈阳性.诱导28 d的细胞CoLⅡ的表达量降低,Ι型胶原(CoLΙ)的表达量显著增高(p<0.05),胞外蛋白多糖积累量开始下降,茜素红鉴定细胞Ca2+分泌结果呈阳性,说明细胞进入肥大成熟期,之后开始向骨细胞分化;诱导35 d的细胞CoLⅡ和CoLΙ的表达量均降低,胞外蛋白多糖积累量达到最低,Ca2+和胶原量显著高于其他诱导天数的细胞(p<0.05).3、在诱导鹿茸MSCs向软骨分化过程中,c-myc基因整体呈下调表达,在诱导7 d的细胞c-myc表达量最高,之后随诱导时间逐渐下调表达至21 d达到最低,之后虽有上升趋势但与第7 d的表达量相比没有显著差异.综上所述,10 ng/mL TGFβ1可成功诱导塔里木马鹿茸间充质干细胞向软骨细胞分化,分化后的细胞具有分泌软骨标志物的功能.初步认为细胞软骨分化过程中c-myc的下调表达诱导了鹿茸MSCs软骨分化的发生.
- 作者：
- 王姗姗
- 学位授予单位：
- 塔里木大学
- 专业名称：
- 动物营养与饲料科学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2016年
- 导师姓名：
- 韩春梅
- 中图分类号：
- S825
- 关键词：
- 塔里木马鹿；鹿茸；间充质干细胞(MSCs)；诱导分化；c-myc基因
- Tarim Wapiti； Antle； Mesenchymal stem cells； Induced differentiation； c-myc gene