刺参MMP及TIMP基因的克隆及在自溶过程中的变化研究
海参是一种对外界环境极其敏感的动物,环境理化因素的变化都能诱发其自溶,造成细胞外基质蛋白的降解.基质金属蛋白酶是一大类细胞外蛋白水解酶,几乎可以降解细胞外基质的所有成分.MMPs的活性受基质金属蛋白酶抑制剂的严格调控.前期研究表明,MMP是参与海参自溶的一类重要蛋白酶.而海参自溶过程中,MMP及TIMP在基因水平的表达情况尚无报道.因此,本文克隆了海参MMP-1和TIMP-1基因,对其组织分布及自溶过程中的表达情况进行了研究.以期从MMP-1/TIMP-1基因表达调控的角度,揭示海参自溶机制.提取海参肠RNA,逆转录后采用PCR扩增及RACE,得到MMP-1及TIMP-1基因序列.采用实时荧光定量RT-PCR法检测其在海参六种组织及自溶过程中的表达水平.结果表明,MMP-1全长cDNA为1691bp,编码507个氨基酸;TIMP-1全长cDNA包含721bp,编码192个氨基酸.在体壁背部、体壁腹部、肠道、呼吸树、体腔液细胞和纵行肌中,MMP-1在呼吸树中的相对表达量最高,TIMP-1在体腔细胞中的相对表达量最高;海参自溶过程中两个基因的表达量均呈现先上调后下降的趋势,自溶6h,管足和背部上皮组织的TIMP-1表达量出现最大值,分别是Oh的3.48倍和5.41倍.而同一时间点,MMP-1基因在上述两种组织中的表达量分别是0h的3.75倍和1.53倍.管足中MMP-1表达量的增加幅度略大于TIMP-1,而背部表皮中MMP表达量的增加幅度则低于TIMP-1.另外,还构建TIMP-pET21b重组质粒并转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,得到重组TIMP-1.优化的诱导表达的条件为IPTG诱导浓度是0.4mM、诱导温度是37℃.上述结果表明,MMP-1及TIMP-1的基因在海参多种组织均有分布,并具有一定器官选择性;在海参自溶过程中,管足和背部上皮组织中MMP-1和TIMP-1表达量均上调,MMP/TIMP比例显著改变,平衡被打破,很可能是导致海参结构蛋白降解,发生自溶的主要原因之一.重组TIMP蛋白的获得为深入研究TIMP对MMP的调控作用奠定了基础.
- 作者：
- 牛海玲
- 学位授予单位：
- 大连工业大学
- 专业名称：
- 水产品加工及贮藏工程
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2014年
- 导师姓名：
- 朱蓓薇；孙黎明
- 中图分类号：
- S917.4；Q78
- 关键词：
- 刺参；MMP-1；TIMP-1；自溶；表达
- Stichopus japonicus； MMP-1； TIMP-1； expression； autolysis