金黄色葡萄球菌AgrC/AgrA双组份信号转导模型的构建与评价
金黄色葡萄球菌作为人类重要的致病菌,能引起多种感染.附属基因调节系统作为毒力因子的调控系统,在其致病过程中发挥着重要作用.该系统包含一个双组份信号转导系统(AgrC/AgrA),AgrC负责感知外源信号刺激并将信号传递到胞内的AgrA,磷酸化后的AgrA可以特异性的与下游启动子P2P3之间的序列结合,并进而引起相关毒力因子的表达与释放.体外研究表明,AgrA异源表达过程中,往往在获得高水平表达的同时,容易被宿主蛋白酶降解或者形成包涵体,不利于目的蛋白功能活性的研究.并且,膜蛋白AgrC在细胞膜上具有拓扑取向性,使得在体外研究双组份信号转导系统变得更加困难.因此,欲对金黄色葡萄球菌双组份信号转导系统的研究,首先需要解决AgrA可溶性表达的问题和AgrC在人工膜中的取向问题.该研究将为体外筛选和开发抗金黄色葡萄球菌感染的新药奠定一定基础.首先,采用无限制克隆法构建AgrA表达载体,在AgrA蛋白的C端融合绿色荧光蛋白(GFP)标签,通过实时监测GFP的荧光强度来快速检测重组蛋白的表达水平.利用单因素实验筛选出宿主菌株;然后,结合Box-Behnken试验设计,筛选出最优蛋白表达条件.其次,利用表面活性剂介导的方法,将金黄色葡萄球菌组氨酸激酶AgrC蛋白重构到磷脂双分子膜上,综合多种表征手段,考察缓冲液、磷脂复合物中负电荷和胆固醇等因素对脂质体稳定性和AgrC镶嵌率的影响,旨在构建一个既能保持AgrC蛋白功能活性,又具有较高的稳定性和膜蛋白镶嵌率的人工膜体系.同时,考查了脂质体不同溶解状态对AgrC蛋白取向的影响.最后,基于AgrA蛋白LytTR区域的非放射性凝胶阻滞实验验证AgrA的生物活性.并在体外初步构建人工模拟的AgrC/AgrA双组分信号转导模型,通过电泳迁移率转移实验,验证该模型的有效性,与此同时,考察了膜蛋白AgrC对EMSA实验的影响.结果如下:1.选用大肠杆菌BL21-plysS作为宿主表达菌株,在诱导时间为22 h、转速为222 rpm、诱导剂浓度为0.5 mM条件下诱导表达,利用镍离子金属螯合层析和分子筛层析纯化后的AgrA产量达到5.56 mg/L.2.以HEPEs为脂质体制备的最佳缓冲液,DOPC/DPPA/chol(2/2/1,mol/mol/mol)为最佳磷脂组分,蛋白和磷脂以摩尔比1/500进行镶嵌,制备得到最优的蛋白镶嵌体系.当脂质体溶解至饱和状态时对蛋白进行镶嵌,得到的AgrC蛋白脂质体中有60%~70%的AgrC蛋白细胞质域朝向脂质体内部,与天然生物膜中AgrC蛋白细胞质域取向一致,并保持较高活性.3.基于AgrA蛋白LytTR区域的非放射性凝胶阻滞实验,证明了所纯化的AgrA蛋白具有生物活性.双组分信号转导系统模型能增强AgrA对DNA的延滞作用,证明了AgrC/AgrA双组分信号转导模型的有效性.通过AgrC对EMSA实验分析,由于蛋白脂质体能更好的维持膜蛋白AgrC的活性,因此对EMSA实验具有显著影响.综上所述,通过体外构建双组分信号转导模型,不仅成功解决了转录调节因子AgrA可溶性表达的问题,而且构建了一个可以人为控制AgrC拓扑取向并保持膜蛋白生物活性的人工膜镶嵌体系.借助于EMSA实验,验证了初步构建的双组分信号转导系统模型的有效性,为下一步体外筛选抑制金黄色葡萄球菌信号传递的抑制剂奠定了基础.
- 作者：
- 张旭宁
- 学位授予单位：
- 大连工业大学
- 专业名称：
- 轻工技术与工程
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2015年
- 导师姓名：
- 权春善
- 中图分类号：
- R378.11
- 关键词：
- 金黄色葡萄球菌；AgrA；AgrC；脂质体；EMSA
- S.aureus； AgrA； AgrC； Liposome； EMSA