三个Tetraspanin蛋白的表达及其在WSSV感染中的作用分析
白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是目前对虾养殖业最严重的病原,给全世界范围内的对虾养殖业带来了巨大损失,到目前为止尚无有效的治疗手段.因此分析WSSV的侵染机制和致病机理对寻找WSSV的防治方法至关重要.Tetraspanin蛋白是一类较保守的四次跨膜糖蛋白,广泛分布于不同物种中.通过形成tetraspanin蛋白网格参与细胞生长、信号转导等生命活动,此外在病原的侵染、肿瘤细胞迁移等免疫过程中也起到重要作用.本文研究了tetraspanin蛋白在WSSV感染中的作用,主要研究内容包括以下几个方面:第一章:根据Gen Bank公布的中国明对虾Tetraspanin-3(Fc T3)基因序列,设计特异性引物,经PCR扩增得到Tetraspanin-3蛋白大胞外环区域(Large extracellularloop,LEL)的基因片段,酶切后成功构建原核表达载体p BAD/gⅢA-T3L并转化入大肠杆菌TOP10感受态细胞中.测序正确的菌株进行扩大培养,经L-阿拉伯糖诱导表达.采用钴离子亲和层析法纯化表达的蛋白,质谱分析显示表达的蛋白为Fc T3蛋白.利用Far-Western-blot技术分析Fc T3L重组表达蛋白与WSSV结构蛋白间的相互作用,结果显示Fc T3L与WSSV的VP26蛋白有相互作用.进一步利用ELISA技术分析显示,Fc T3L与VP26的相互作用随VP26蛋白量的增加而增强.第二章:利用Gen Bank公布的中国明对虾CD63(Fc CD63)基因序列,设计特异性引物,经PCR扩增得到CD63蛋白大胞外环区域(Large extracellularloop,LEL)的基因片段,构建原核表达载体p BAD/gⅢA-CD63L并转化入大肠杆菌TOP10感受态细胞中进行表达纯化.纯化的重组蛋白经质谱验证为中国明对虾CD63L蛋白.Western-blot分析结果显示Fc CD63与WSSV的VP28蛋白存在相互作用,并且Fc CD63与VP28C和VP28N均能相互作用.ELISA分析显示两蛋白间相互作用存在浓度依赖性.中和实验显示Fc CD63L重组蛋白能延缓WSSV的入侵,对对虾起到明显的保护作用.第三章:利用c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)克隆得到凡纳滨对虾CD63(Lv CD63)的c DNA序列.序列全长1472 bp,编码区长744 bp,编码247个氨基酸,预测分子量27 KD.生物信息学分析显示序列与斑节对虾CD63序列存在93%相似度,与中国明对虾CD63存在92%相似度.Real-time PCR分析显示Lv CD63基因在凡纳滨对虾血淋巴、鳃、上皮组织、心脏、类淋巴、肝胰腺、胃、肠道、肌肉和神经组织中均有表达,其中在血淋巴中相对表达量最高,其次是上皮、肝胰腺和神经组织,在肌肉组织中表达量最低.WSSV感染对虾后,对虾鳃和上皮组织中凡纳滨对虾CD63基因的表达量明显的上调,而肝胰腺中表达出现下调.Far-Western blot分析显示Lv CD63与WSSV VP28蛋白存在相互作用,且与VP28N和VP28C均能相互作用.流式细胞分析表明Lv CD63在血细胞表面有分布.感染实验显示,Lv CD63蛋白可以延缓WSSV的感染..
- 作者：
- 关广阔
- 学位授予单位：
- 上海海洋大学
- 专业名称：
- 生物学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2015年
- 导师姓名：
- 刘庆慧
- 中图分类号：
- S945.4
- 关键词：
- 对虾白斑综合征病毒；Tetraspanin-3；CD63；中国明对虾；凡纳滨对虾
- WSSV； Tetraspanin-3； CD63； Fenneropenaeus chinensis； Litopenaeus vannamei