基于LAMP法分离贝类中致病性副溶血性弧菌及其生长模型的建立
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种广泛分布在近海沿岸海水、底泥以及各类海产品中的革兰氏阴性杆状菌,也是我国目前首要的食源性致病菌.食用被该菌污染的海产品会导致恶心、呕吐等急性肠胃炎症状,尤其是生食或半生食的贝类产品如牡蛎等,极易引发副溶血性弧菌中毒事件.从1992-2013年我国副溶血性弧菌的污染数据表明,我国沿海主要城市海产品中副溶血性弧菌的检出率均在30%以上,检出率最高可达到80%,尤其在夏秋两季和贝类海产品中有相对较高的检出率.然而,由于副溶血性弧菌分为致病性(携带毒力基因)和非致病性两种,绝大多数都是非致病的.这些污染调查数据均未对副溶血性弧菌的毒力基因开展进一步的分析和研究,所检样品包含非致病性副溶血性弧菌.因此,很难通过这些检出率的高低来确定其真实的危害程度.为了进一步分析和研究海产品中致病性副溶血性弧菌的污染情况,以便更加真实地掌握其风险程度.本研究采用环介导等温扩增法(LAMP)检测贝类产品中的致病性副溶血性弧菌,并对分离得到的副溶血性弧菌建立合适的生长模型,目的是降低该菌引起的食源性疾病发生的风险.实验研究结果如下:1.LAMP法检测上海市售贝类产品中致病性副溶血性弧菌基于环介导等温扩增法对上海市8-10月市售贝类产品中致病性副溶血性弧菌(tdh和trh毒力基因)进行检测分析,共检测贝类样品180份,6个常规品种,同时采用PCR测定方法进行对比.结果表明,含tdh和trh毒力基因的副溶血性弧菌在市售贝类中的检出率分别是12.77%和11.66%,PCR的分析结果为11.11%和7.78%.对分离的5株致病性副溶血性弧菌进行血清型分型后发现了2株O3:K6型副溶血性弧菌,其中一株为毒力基因双阳性菌(tdh+/trh+),PFGE分析表明这2株菌的基因条带存在一定差异.这些结果表明上海市售贝类产品中致病性副溶血性弧菌存在一定的污染,应引起足够重视.PCR检测结果对比分析表明,LAMP方法适用于贝类产品中致病性副溶血性弧菌的检测分析.2.副溶血性弧菌在牡蛎中的生长模型构建采用LAMP检测实验中分离的副溶血性弧菌致病性菌株、非致病性菌株和致病性副溶血性弧菌标准菌株于35℃、25℃、15℃和5℃下在碱性蛋白胨水、牡蛎肉和活牡蛎中绘制生长动力曲线,并利用Excel和Curve Expert 1.4软件对数据进行处理分析,分别采用Richards模型、MMF模、Gompertz模型和Logistic模型对数据进行拟合,建立致病性副溶血性弧菌在贝类产品中的最佳生长模型并对其模型进行验证.实验结果表明:(1)在3%Nacl碱性蛋白胨水中副溶血性弧菌非致病性菌株在35℃、25℃和15℃时较致病性菌株有更高的生长速率,在5℃时有最低的消减速率,说明副溶血性弧菌非致病性菌株比致病性菌株更适应液体基质中的生长环境.在牡蛎肉和活牡蛎中,在35℃、25℃和15℃时样品分离菌株较实验室致病性副溶血性弧菌标准菌株有更高的生长速率,15℃时样品分离菌株中的致病性副溶血性弧菌具有最高菌浓度值,5℃时具有最低的消减速率,说明致病性副溶血性弧菌比非致病性副溶血性弧菌更适应在贝肉和活体贝类中的生长.(2)在适用模型构建中,MMF模型在水体基质35℃、25℃和15℃时的拟合效果最好,在贝肉基质25℃和活体贝类15℃中的拟合效果最好.Richards模型在贝肉基质35℃和活体贝类35℃、25℃中具有最好的拟合效果.Logistic模型适用于5℃水体基质、贝肉基质和活体贝类,也是贝肉基质15℃时的最佳生长模型.对活体贝类中所建立的温度模型的可信性在实验室条件下进行评估,最大比生长速率的残差都在±0.05的范围内,这表明该预测模型在95%的水平上是可信的.
- 作者：
- 韩小龙
- 学位授予单位：
- 上海海洋大学
- 专业名称：
- 食品科学与工程
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2015年
- 导师姓名：
- 沈晓盛
- 中图分类号：
- TS201.3
- 关键词：
- 副溶血性弧菌；环介导等温扩增；tdh基因；trh基因；生长模型
- Vibrio parahaemolyticus； LAMP； tdh gene； trh gene； growth model