生物催化法制备L-叔亮氨酸
叔亮氨酸是一种非蛋白原的手性氨基酸,具有占位空间大的叔丁基链,它能够很好地控制分子构象,增加多肽的疏水性和受酶降解的稳定性,因此在临床上可用于抗癌、抗艾滋病等药物的合成.化学合成叔亮氨酸存在污染大、收率低、步骤多等缺点,近年来,利用微生物转化法合成叔亮氨酸已经成为研究的热点.本课题研究利用细菌全细胞作为催化剂,以三甲基丙酮酸和甲酸铵为底物,催化合成L-叔亮氨酸,通过实验研究,确定了产物转化及分析方法、发酵培养基组成以及转化工艺.首先,本论文对检测方法进行了研究,经过对薄层色谱法、OPA衍生法及HPLC直接检测法的探讨,最终确定用HPLC直接检测法作为表征方法.HPLC直接检测的高效液相色谱检测条件,采用C18烷基硅烷键合反相柱、流动相为0.25%磷酸二氢铵:甲醇=100:5(v/v)、流速0.8mL/min、采用恒流洗脱、紫外检测器波长205nm.其次,实验用两种基因工程菌E.coli R1&E.coli R2作为实验菌种.经过实验,优化了E.coli R1&E.coli R2的发酵培养基:牛肉膏1.0%,蛋白胨1.0%,酵母浸粉3%,葡萄糖0.3%,磷酸氢二钾0.3%,硝酸铵0.5%,NaCI0.4%,硫酸镁0.01%.并获得了菌种最佳培养和产酶条件:接种量5%,pH7.2,发酵温度32℃,培养时间21小时.再次,通过优化转化工艺,得到最佳转化反应条件:反应温度30℃,菌体添加量15%,两种产酶菌体湿重比(E.Coli R1:E.Coli R2)为2:1(g/g),在pH7.2.0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中反应,反应时间24h,底物比率0.15M:0.2M,L-叔亮氨酸产率达到68%.最后,采用聚乙烯醇(PVA)作为包埋剂,添加海藻酸钠(CA)起助形作用,混合硼酸溶液为交联剂,包埋固定化细菌.对固定化条件进行了初步的探讨,0.15mol/L三甲基丙酮酸,0.2mol/L甲酸铵,1mmol/L NADH,菌体添加量为15%(g/ml),0.1mol/L的磷酸氢二钾缓冲溶液溶解,反应温度30℃,摇床振荡反应72h.
- 作者：
- 邓晟
- 学位授予单位：
- 大连工业大学
- 专业名称：
- 应用化学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2013年
- 导师姓名：
- 孙岩峰；崔励
- 中图分类号：
- O629.71
- 关键词：
- 微生物转化；L-叔亮氨酸；固定化；三甲基丙酮酸
- Microtransformation； L-tert-leucine； immobilization； three methyl pyruvate