鸭瘟强毒株和弱毒株在感染鸭体内的动态分析研究
Dynamic Analysis of Duck Enteritis Virus Virulent Strain and Its Attenuated Strain in Experimentally Infected Ducklings
鸭病毒性肠炎(Duck Viral Enteritis,DVE),又名鸭瘟(Duck Plague,DP),是由鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)引起的常见于鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性、高度接触性传染病.主要特征是损伤血管、引起消化道黏膜出血坏死、淋巴器官和实质性脏器出现退行性病变.发病率和死亡率都很高,给养鸭业带来了巨大损失.目前预防和控制DVE的主要措施是疫苗免疫,而研究病毒在动物机体中的分布与增殖规律是阐明病毒致病机理和免疫机理的重要基础,因此有必要建立分子生物学方法研究DEV强毒和弱毒在感染鸭体内的动态分布规律,以阐明DEV强毒的致病机理,同时为进一步合理、有效利用疫苗预防鸭瘟提供依据.本试验根据DEV CSC强毒株及其传代致弱毒株DEV p80的基因序列差异,建立了检测鸭瘟强、弱毒通用型和鸭瘟强、弱毒鉴别型两种SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法.结果显示,两种方法建立的标准曲线均具有良好的线性关系,相关系数均为1.0,熔解曲线分析均为特异性单峰,Tm分别为80.5±0℃、81.5±0℃,并且与正常鸭组织以及其他禽源病毒如鸭病毒性肝炎病毒、鸡新城疫病毒、巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌均不发生交叉反应.重复性试验的变异系数均小于2.5%.敏感性试验中,鸭瘟强、弱毒通用型荧光定量PCR方法可检测出9.072copies的pMD18T-gD,检测强毒CSC株的最低含量为1个MLD(7.42copies),弱毒p80株的最低含量为100.5个TCID50(40.5copies).鸭瘟强、弱毒鉴别型检测荧光定量PCR方法可检测出4.77copies的pMD18T-gI,检测到强毒CSC株的最低含量为1个MLD(4.23copies).表明本试验建立的方法具有较好的特异性、重复性和敏感性.应用已建立的鸭瘟强、弱毒通用型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法对DEV CSC强毒株、DEV p80弱毒株分别在感染鸭胸腺、脾脏、法氏囊、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、十二指肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、大脑、三叉神经节、血清和泄殖腔分泌液中的动态分布进行了检测.结果显示,DEV CSC株可在接种后6h即可在所有受检组织检测到,随后DEV CSC株DNA拷贝数持续升高至接种后5d免疫鸭死亡,其中结肠病毒DNA拷贝数为最高,达到1013.26copies,法氏囊、肝脏和盲肠次之,约1012copies.表明鸭瘟强毒CSC株对感染鸭的免疫器官、神经组织和消化系统均具有广泛的嗜性.而DEV p80株的DNA拷贝数于接种后在受检样品中整体上呈先上升后下降的趋势,且各组织器官中病毒DNA拷贝数最高值存在一定的差异,其中胸腺最高,约108.92copies,大脑和肝脏次之,分别为108.14copies、107.97.copies.DEV p80株在免疫鸭各组织脏器中的分布与鸭瘟强毒CSC株大体相似,但组织中病毒DNA拷贝数均明显低于鸭瘟强毒CSC株,其中脾脏、胰腺、消化道、泄殖腔拭子中差异最明显,约比DEV CSC强毒株的峰值下降了6个数量级,法氏囊和肝脏次之,分别下降5、4个数量级,而胸腺、大脑和三叉神经差异不明显,下降约1~2个数量级.最后,本试验利用建立的鸭瘟强、弱毒鉴别型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法对DEVCSC强毒株在p80弱毒株免疫鸭泄殖腔中的动态分布进行了检测.结果显示,两者的动态增殖规律具有显著的差异,DEV CSC强毒株DNA拷贝数在攻毒对照鸭中持续升高至对照鸭死亡,而p80弱毒株免疫鸭一直维持在较低水平,远远低于攻毒对照鸭.表明DEV p80弱毒株接种鸭后可抵抗致死性强毒攻击,且排毒量下降了5个数量级.DEV p80弱毒有望开发成活疫苗,用于鸭瘟防控.
- 作者：
- 文晶亮
- 学位授予单位：
- 中国兽医药品监察所
- 专业名称：
- 预防兽医学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2014年
- 导师姓名：
- 夏业才
- 中图分类号：
- S852.65
- 关键词：
- DEV；强弱毒；实时荧光定量PCR；鸭；分布
- DEV；Virulent/Attenuatedstrain；real-time fluorescent quantitative PCR；Duck；Distribution