荧光标记的溶菌酶基因(Lyz-GFP)对苜蓿不同品种转化和表达的研究
The Study on Transformation and Expression of Lysozyme Gene Labeled with Fluorescent in Different Varieties of Alfalfa
苜蓿(Medicago sativa L.)是世界上分布最广的多年生豆科牧草之一,病害严重地威胁着苜蓿生产,病害的发生降低其生产性能,危害家畜健康,降低草品质量,严重时造成苜蓿大量死亡.本研究运用农杆菌介导法,将有荧光标记的广谱抗病基因-溶菌酶基因转入苜蓿中,使之得以表达,以期提高苜蓿的抗病性能.本研究以适宜于西北地区生长的苜蓿栽培品种甘农1号杂花苜蓿、甘农3号紫花苜蓿,新疆大叶紫花苜蓿为供试材料,成功建立了3个品种的植株再生体系;进行农杆菌介导的基因转化研究,将溶菌酶基因与荧光蛋白标记基因组成的双元基因(Lyz-GFP)转入材料下胚轴,获得转基因植株;并对侵染后外植体再生过程和基因转化过程中的各种影响因素进行了探讨,分别确定了二者的优化条件.并对转化植株进行了荧光检测和PCR扩增检测,获得了新疆大叶苜蓿转化植株中存在目标基因片断的证据.具体研究内容及结果如下:1.进行了苜蓿3个品种植株再生的研究,建立苜蓿高频再生体系.以苜蓿3个品种不同部位为外植体,进行其愈伤组织诱导、分化及生根研究.结果表明:甘农1号苜蓿下胚轴愈伤组织诱导率和体细胞胚形成率最高可达97.2%和70.9%,新疆大叶苜蓿下胚轴次之,甘农3号出愈率和体细胞胚形成率均较低,前2个品种在苜蓿组织培养中较易再生;苜蓿下胚轴是理想的外植体.苜蓿愈伤组织诱导以2.0mg/L2,4-D单独处理或2.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT组合处理为最佳,在此激素浓度处理下,下胚轴愈伤组织诱导率最高可达97.2%,激素处理时间以20d为宜;体细胞胚的发育则以2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA的激素组合处理为宜,在此激素浓度处理下,体细胞胚形成率最高可达70.9%.适宜的生根培养基为1/2MS+1.0mg/L IBA+1%蔗糖+0.7%琼脂.体细胞胚形成阶段培养基添加25~30g/L的蔗糖较适宜于愈伤组织分化.2.探索了苜蓿基因转化的适宜条件,优化了其基因转化体系及侵染后外植体再生条件.转化中选择50~60mg/L卡那霉素(Kan)作为甘农3号苜蓿转化子筛选剂及其适宜筛选浓度,75~80mg/L Kan作为甘农1号和新疆大叶苜蓿转化子的Kan筛选压;250mg/L头孢霉素(Cef)作为甘农3号和新疆大叶苜蓿转化组织适宜的抑菌素作用浓度,300mg/L作用于甘农1号转化组织脱菌;转化中宜选择菌液浓度OD600为0.3~0.5、100r/min摇床震荡、侵染时间为10min;甘农1号和新疆大叶苜蓿侵染后的下胚轴再生能力较强,适合作为转化受体;适合于经侵染的苜蓿下胚轴段愈伤组织诱导和分化的激素配比分别为2.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT和2.0mg/L6-BA+0.5mg/L NAA,在此处理下3个苜蓿品种侵染后下胚轴段愈伤组织诱导率分别可达到甘农1号83.3%,甘农3号87.7%,新疆大叶81%.分化率分别为甘农1号43.7%,新疆大叶41.1%,甘农3号21.4%.3.在此转化和再生条件下共获得抗性植株数量为甘农1号53株,甘农3号5株,新疆大叶46株;荧光跟踪显微检测不同阶段的转化子,甘农1号苜蓿3株,新疆大叶苜蓿4株植株呈阳性反应,阳性植株转化率分别为5.7%和8.7%;对此7株经荧光检测阳性植株进行PCR鉴定,得到新疆大叶苜蓿1株转基因植株.
- 作者：
- 史毅
- 学位授予单位：
- 甘肃农业大学
- 专业名称：
- 草业科学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2013年
- 导师姓名：
- 马晖玲
- 中图分类号：
- S541.9
- 关键词：
- 苜蓿；植株再生；愈伤组织；体细胞胚；农杆菌介导；溶菌酶Lyz基因；绿色荧光蛋白GFP转基因植株；转基因植株
- Alfalfa；plant regeneration；callus；somatic embryo；Agrobacterium-mediated；Lysozyme gene；Green fluorescence protein gene；Transgenic plant