棉花GhMDH基因的克隆及其功能分析
Cloning and Functional Analysis of GhMDH Gene of Gossypium Hirsuturm L.
苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH)广泛存在于各种生物体内,参与生物体的糖代谢、脂代谢等多种代谢途径.其主要功能是催化苹果酸与草酰乙酸的可逆转化.除此之外苹果酸脱氢酶还与植物的抗逆胁迫相关.本研究利用3',5'-RACE技术,从棉花叶片中克隆出苹果酸脱氢酶基因,命名为GhMDH.把GhMDH基因分别插入到pET-23b和pBin438上,构建了原核表达载体pET-23b-GhMDH和真核表达载体pBin438-GhMDH.将pET-23b-GhMDH导入大肠杆菌(E. coli) BL21(DE3)中进行酶蛋白的诱导和表达;将pBin438-GhMDH导入农杆菌(Agrobacterium tumefacious)菌株LBA4404中,通过农杆菌介导法获得转基因烟草植株,并进行了耐铝性分析.获得的主要研究结果如下:1.根据棉花盐胁迫相关的EST序列设计特异性引物,利用3',5'-RACE技术,以"中棉所35"的RNA进行目的片段5'和3'末端的扩增.将5'-RACE和3'-RACE产物电泳检测、回收并连接到pGEM-T载体上,获得重组质粒pGEM-T-GhMDH,转化大肠杆菌感受态DH5α细胞获得阳性克隆进行序列测定,将测序结果用DNAMAN进行拼接,结果表明GhMDH基因全长1130bp,开放阅读框1014bp,编码338个氨基酸,预测的蛋白分子量为35.495KDa,等电点pI=8.94.2.双酶切克隆载体pGEM-T-GhMDH和原核表达载体pET-23b,回收目的基因以及载体片段,定向连接构建了原核表达载体pET-23b-GhMDH.通过热激法将pET-23b-GhMDH导入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用IPTG进行蛋白诱导,诱导出大小约为35KDa的MDH蛋白,并通过测该酶在反应体系L-苹果酸与NAD反应下生成NADH量进而测NADH在340nm处吸光值的变化来对该蛋白进行酶活性测定,经计算GhMDH的活性为2.58U,比活力为129U/mg.3.双酶切克隆载体pGEM-T-GhMDH和真核表达载体pBin438,回收目的基因以及载体片段进行连接构建了植物表达载体pBin438-GhMDH.采用电激法转化烟草,获得9株转化植株,对经PCR和RT-PCR检测呈阳性的8株转基因植株进行耐铝性测定,结果表明转基因植株对铝毒的耐受性明显高于对照植株.
- 作者：
- 李青
- 学位授予单位：
- 甘肃农业大学
- 专业名称：
- 植物学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2013年
- 导师姓名：
- 张宁；吴家和
- 中图分类号：
- Q943.2
- 关键词：
- 棉花；苹果酸脱氢酶基因；表达载体；原核表达；真核表达；转基因烟草；基因表达分析
- Gossypium hirsuturm L.；Malate dehydrogenase；Expression vector；Prokaryotic expression；Eukaryotic expression；Transgenic tobacco plants；Geneexpression analysis
- 基金项目：
- 国家自然科学