牦牛肉组织蛋白酶L的分离纯化及部分特性研究
Purification and Some Characterization of Cathepsin L from Yak Meat
嫩度是决定牛肉食用品质的关键性因素,成熟是目前全世界公认的提高嫩度的最有效途径.嫩度的变化主要是由内源蛋白酶对牛肉中肌原纤维蛋白的水解作用引起的.组织蛋白酶L是与牛肉嫩化密切相关的一类内源蛋白酶,在畜禽宰后成熟过程中发挥着重要作用.因此,有必要分离纯化出对牛肉品质起关键调控作用的组织蛋白酶L,为进一步研究牛肉成熟机制以及实际生产中提高品质奠定一定理论基础.本研究以青海大通牦牛肉背最长肌为原料,运用响应面分析法、正交试验设计、均匀试验设计等统计方法对牦牛肉中组织蛋白酶L的分离、纯化工艺条件进行研究,并对经纯度鉴定后的组织蛋白酶L进行部分特性研究,试验结果如下:1.酶活性测定:牦牛肉组织蛋白酶L的特异性荧光底物为Z-Phe-Arg-AMC,底物的最适反应浓度为25μmol/L,酶与底物的最佳反应时间为30min.2.分离提取工艺:显著影响酶活力的因素有:浸提缓冲液pH值、L-Cys和硫酸铵饱和度,且影响均呈正效应,主次顺序为:浸提缓冲液pH值>硫酸铵饱和度>L-Cys.最佳分离提取工艺为:乙酸钠浸提缓冲液pH值为5.70、L-Cys浓度为6.46mmol/L、硫酸铵饱和度为76.39%.此条件下,酶的比活力为90.33U/mg,提取率为0.153g/mg.3.纯化工艺:DEAE-Sephacel阴离子交换层析最佳纯化参数为:上样体积1mL、体积流速0.6mL/min、NaCl洗脱浓度0.2~2.0mol/L,其对组织蛋白酶L比活力影响主次顺序为:体积流速>NaCl洗脱浓度>上样体积.最优工艺条件下,测得的比活力为194.80U/mg,纯化倍数为9.90,收率达28.52%.Sephacryl S-100凝胶过滤层析最佳纯化条件为:体积流速为0.2mL/min,上样体积为1.2mL.对比活力影响主次顺序为:体积流速>上样体积.此方案下,组织蛋白酶L的比活力为294.12U/mg,纯化倍数为15.03,收率达23.11%.SDS-PAGE鉴定纯度达到电泳纯,分子量约为36ku.4.酶学特性:最适反应pH值和温度分别为5.5和40℃,在pH5.0~5.5、20~40℃的条件下酶活稳定性最高;专一性荧光底物为Z-Phe-Arg-AMC;金属离子Ca2+、Cu2+、Mn2+、K+、Fe3+、Fe2+、Zn2+对该酶均有不同程度的抑制作用;L-Cys和β-ME能激活该酶,EDTA和EGTA有轻微的抑制作用.综上所述,采用硫酸铵沉淀、盐析、透析、超滤浓缩以及DEAE-Sephacel阴离子交换层析、Sephacryl S-100凝胶过滤层析色谱法等技术从牦牛肉中将组织蛋白酶L分离纯化至电泳纯,该酶水解专一性荧光底物Z-Phe-Arg-AMC,具有耐酸耐热性,可被金属离子抑制,分子量为36Ku,属于含有巯基的半胱氨酸型蛋白酶.
- 作者：
- 王文婷
- 学位授予单位：
- 甘肃农业大学
- 专业名称：
- 食品科学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2013年
- 导师姓名：
- 韩玲
- 中图分类号：
- TS251.1
- 关键词：
- 牦牛肉；嫩度；组织蛋白酶L；分离纯化；酶学特性
- yak meat；cathepsin L；tenderness；purification；enzymatic characteristics
- 基金项目：
- 国家自然科学