典型纳米材料及制剂的毒理学研究
Toxicology Studies of Typical Nanomaterials and Nanoformulation

本研究探讨了纳米四氧化三铁、碳纳米管、纳米二氧化钛和纳米制剂体内外的毒性作用,主要内容如下:一、纳米材料对A549细胞的毒性作用:本研究是为了探讨纳米四氧化三铁、不同性质的碳纳米管和纳米二氧化钛对体外培养的人肺上皮细胞A549的影响.细胞形态学的变化通过倒置相差显微镜观察,通过MTT法、CCK-8法和台盼蓝排斥法测定细胞的活性并测定不同纳米材料处理后细胞培养上清中LDH酶活性.试验结果表明,纳米四氧化三铁在100μg/ml的剂量下,对A549细胞的存活率没有明显的影响;纳米二氧化钛在200μg/ml的剂量下,对A549细胞的存活率也没有明显的影响;对碳纳米管的细胞毒性研究发现,上述几种评价细胞毒性的方法所得结果不完全一致,CCK-8法表明在高浓度下,细胞的存活率甚至低于20%,然而在光镜下却没有观察到细胞活性有明显的降低,LDH法和细胞计数也进一步证明了碳纳米管对细胞的存活率没有明显影响,所有结果提示:碳纳米管可能会与染料发生相互作用,导致假阳性结果.二、纳米材料对ICR小鼠的急性毒性作用:本部分实验是为了观察小鼠经口单次灌胃纳米材料后可能产生的急性毒性反应.纳米二氧化钛和单壁碳纳米管在5g/kg剂量下、多壁碳纳米管在1g/kg的剂量下单次经口灌胃,14天后,小鼠处死.检查指标包括体重、摄食量、血清生化、脏器系数和组织病理学.结果表明,纳米二氧化钛和碳纳米管对小鼠体重和脏器系数没有明显的影响,实验期间小鼠的摄食量逐渐增加.观察期间也未见动物出现明显毒性反应和死亡,尽管部分血清生化有明显的改变,但除纳米二氧化钛雄性动物CK值外,均在正常范围内波动,组织病理学观察未见明显异常.在本试验条件下,纳米材料属于低毒或无毒物质.三、纳米二氧化钛对SD大鼠的亚慢性毒性研究:本部分实验是为了探讨纳米二氧化钛对SD大鼠的亚慢性毒性,观察其引起的毒性反应,提供毒性反应的靶器官及其损害的可逆情况.纳米二氧化钛在1g/kg剂量下,连续染毒3个月,灌胃纳米二氧化钛后均无异常征状可见,观察期间也未见动物出现明显毒性反应和死亡.动物的摄食量、体重变化与空白对照相比,没有显著性改变.血液和生化检查结果显示,与空白对照组相比,部分参数差异显著,但除纳米二氧化钛组雌性大鼠染毒末BUN和CREA值、微米二氧化钛雌性大鼠染毒末M值外均在本实验室正常范围内波动,没有毒理学意义.对染毒末和恢复期末所有动物的组织学病理观察未见明显的病理学改变,骨髓涂片也均未见明显的骨髓细胞形态学改变及毒性病理变化.四、纳米二氧化钛组织分布学研究:本研究中,通过ICP-MS检测了纳米二氧化钛经口灌胃13周后在大鼠中的分布情况.所取样品包括肝、脾、肾、肠、脑和血液.钛浓度分析结果表明,大鼠经口重复染毒纳米二氧化钛后,可以通过胃肠道吸收而使纳米二氧化钛滞留在体内,并主要分布在肠、肝和脾中.提示纳米二氧化钛经口暴露后,可以通过胃肠道吸收并分布到体内其它组织和器官,但对生物体可能不会产生明显影响.五、纳米制剂对beagle犬的皮肤毒性及其可能机制:研究了beagle犬静脉给予纳米制剂的皮肤毒性和毒代动力学,给药12周,每4周1次.我们每周1次评价了beagle犬的皮肤毒性.发现空白对照组、赋形剂组和普通制剂(0.45mg/kg)组动物,整个试验期间均未见明显皮肤毒性反应.0.1、0.3和0.45mg/kg组皮肤毒性的主要表现为四肢、颌下、腹部的脱毛、红斑、渗出、焦痂、溃疡等征状,且有明显的剂量反应关系.毒代动力学结果显示:脂质体药物在犬体内的药代动力学行为符合线性动力学,多次给药后在犬体内不存在蓄积,在改变剂型后,提高了药物在血浆中的停留.普通制剂在血浆中具有极快消除的特性,普通制剂的犬血浆样品中基本未检测到药物,仅在达峰处检到血药浓度,相当于同剂量脂质体的1/100,证明脂质体注射液具有显著体内长循环的特性.对溃烂皮肤和正常皮肤药物浓度分析表明,溃烂皮肤药物浓度显著高于正常皮肤,提示脂质体制剂更易于分布在这些部位导致皮肤毒性.六、纳米材料对体外血脑屏障模型的影响:本部分实验通过原代培养分离得到大鼠脑毛细血管内皮细胞和星形胶质细胞,经形态学和免疫组化鉴定,表明细胞纯度高,可以用于体外血脑屏障模型的构建.然后,我们建立了非接触式体外共培养模型,该模型跨内皮细胞电阻值为373±41Ω·cm2,荧光素钠的通透性为(0.34±0.14)*10-3cm/min,这与文献报道一致.最后评价了几种纳米材料对BBB紧密连接的毒性作用,结果表明,这些纳米材料在100μg/ml的浓度下对BBB紧密连接没有明显的毒性作用.总之,在本试验条件下,无机纳米材料没有表现出明显的体内外毒性作用;可生物降解性纳米制剂由于分布的变化,可能会出现与普通制剂不同的毒性反应;常规物质毒性评价的方法可能不一定适合于纳米尺度下物质的评价.