中药复方提取液对牙周可疑致病菌和人牙周膜细胞作用的临床和实验研究
Clinical and Experimental Research on the Function of Prescriptional Extract from Chinese Crude Drug on Suspicious Periodontally Pathogenic Bacteria and Human Periodontal Ligamental Fibroblasts (HPLF)

目的牙周病是口腔常见病和多发病,是一种发生在牙周支持组织上以细菌为主的感染性疾病,是成年人口腔中病理性失牙最主要的原因.牙周可疑致病菌是牙周病的主要致病因素,是引起牙周组织慢性破坏性疾病的始动因子.消除致病因子和阻断牙周病的发生发展是预防和治疗牙周病的重要手段,如采用龈上下洁刮治术或药物治疗,控制引起牙周病的牙菌斑.长期以来,许多学者对中医药在牙周病的病因、治疗和预防方面都进行了大量的研究,特别是二十世纪八十年代以来,天然药物防治口腔疾病逐渐受到国内外学者的关注.本研究采用名中医干祖望教授推荐的经验方,制成中药复方提取液进行了相关的临床和实验研究,并且按照世界卫生组织《口腔健康调查基本方法》进行牙周健康状况的调查.了解人群牙周健康流行状况,既为开展口腔预防保健提供了基线资料,又进一步说明研究开发防治牙周病药物具有十分重要的意义;探讨中药复方提取液减少牙茵斑的作用和寻找一个合适的用药方法;观察中药提取物对牙周病可疑致病菌的杀菌作用;观察中药复方提取液在不同浓度下对人牙周膜成纤维细胞(HPLF)增殖和总蛋白含量的变化以及观察中药复方提取液对HPLF形态和超微结构的影响.为研究该中药防治牙周病的机制提供实验依据.方法本课题研究分实验研究、临床研究和流行病学研究三个部分1、实验研究中药复方提取液:选用江苏省中医院名中医干祖望教授推荐的防治牙周病的方药(以金银花、紫花地丁、蚤休、芦根等组成),中药材来源于江苏省中医院药剂科.将中药材加5倍量水提取3次,过滤合并滤液,90%乙醇沉淀,离心后去除沉淀,取上清液,浓缩至所需浓度1g/ml作为原液.原液于沸水中煮沸10min,备用.实菌验株及培养基:选用国际标准菌株(由上海交通大学附属第九人民医院口腔医学研究所提供):牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)ATCC 33277、具核梭杆菌(Fusobacterium rlucleatum,Fn)ATCC 25586、伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa)ATCC Y4.用专性厌氧培养基(杭州天和微生物试剂有限公司提供)传代培养.变形链球菌(st reptOCOCCUS mutans,sm)NCTC Ingbritt.用(Ms)轻唾培养基(杭州天和微生物试剂有限公司提供)传代培养.细胞培养:取正畸需要拔除的无龋、无牙周病的10~16岁青少年前磨牙,随即放置于含有100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素预冷的DMEM培养基中,在超净工作台内,无菌条件下,刮取牙根中1/3的牙周膜组织,剪成1mm*1mm*1mm小块,平铺于25ml培养瓶中,加入含有20%血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基2ml,在CO2培养箱中,37℃、5%CO2饱和条件下培养4 h后,翻转培养瓶,继续培养.有细胞游出后,每隔3天换液,细胞长满瓶底壁后,以0.25%胰蛋白酶消化,传代.凡免疫组化角蛋白阴性、波形蛋白阳性的4~10代细胞用于实验.配制系列浓度中药提取液:取1g/ml中药贮存液,用5%血清的DMEM培养基将其稀释成0g/ml(对照组)、1*10-7g/ml、1*10-6g/ml、1*10-5g/ml、1*10-4g/ml、1*10-3g/ml、1*1012g/ml不同浓度的条件培养基.体外敏感试验操作程序(微量液体稀释法):采用TSA血平板培养基.厌氧培养18小时(90%N2 5%CO2 37℃).保存之细菌复苏,经生化鉴定后接种于相应琼脂平板.挑取琼脂表面的单个菌落混悬于相应液体培养基中(1个1mm菌落/ml)培养,培养相应时间后使菌液浓度呈10-6CFU/ml备用.分别吸取两种样品原液.药品液为原液对倍稀释(1:1,1:2,1:4……).体外敏感试验采用微量液体稀释法检测MBC(最小杀菌浓度).MBC测定:用无菌接种环挑取肉眼观察无细菌生长的微孔板中培养物,划线接种于相应平板,放置适宜培养条件下孵育.48h培养后观察,无细菌生长的最低药物浓度为MBC.MTT法测定细胞增殖:取第5代细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,以1*105/ml的细胞浓度接种到96孔板,每孔100μl,培养24h后,吸弃原有培养液,每孔加入条件培养液:200μl,每个浓度8孔.分别于培养1d、3d、5d后,每孔加入MTT(5mg/ml)20μl,37℃,5%CO2饱和条件下培养4h,吸弃培养液,每孔加入DMSO150μl,振荡10min,于酶标仪测定OD值,波长为490nm.仅含有5%血清的培养基作为对照组.考马斯亮蓝染色法测定细胞总蛋白:取第5代细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,以1*105/ml的细胞浓度接种到96孔板,每孔100μl,培养24h后,吸弃原有培养液,每孔加入条件培养液200μl(不包括1*10-2g/ml),每个浓度5孔.分别于培养1d、3d、5d后,每孔加入100μl0.1%TritonX-100,室温下振荡30min,吸取20μl,转移到另一块96孔板,每孔加入考马斯亮蓝染液200μl,室温下振荡10min,用分光光度计在595nm波长处测定溶液的OD值.仅含有5%血清的培养基作为对照组.超微结构:取第5代细胞,用0.25%胰蛋白酶消化接种到新的培养瓶中,培养24h后,吸弃原培养液,加入1*10-3g/ml浓度条件培养液培养5d,以不含中药提取液的5%DMEM培养基作为对照组.第5天用0.25%胰蛋白酶消化,分别收集在离心管中,1000r/min,10min离心后,弃上清液.2%戊二醛固定细胞团块2h,室温下系列丙酮脱水,EPON812包埋,超薄切片后透射电镜观察.2、临床研究中药复方提取液同实验研究,并将其配制成中药低浓度组(0.2g/ml,用蒸馏水稀释)、中药高浓度组(0.4g/ml,用蒸馏水稀释)、阳性对照组(1/2浓度的口泰)、阴性对照组(蒸馏水)4个组分别编为A、B、C、D 4个组.采用双盲法进行实验观察,提供漱口液者不参加实验检查,进行牙周指数检查的人员是经过培训的口腔医生,直接给幼儿提供漱口液并进行监督的是幼儿园老师.实验开始前由口腔医生对幼儿进行牙周指数的检查,再由幼儿园老师安排幼儿漱口,要求每天含漱2次,每次用量10ml,含漱2分钟后吐干净,连续二周,最后一次漱口完后1hr由口腔医生检查牙周指数.整个实验过程中幼儿不改变平时的生活习惯.测量牙周指数,包括菌斑指数(plaqueindex,PLI)和牙龈指数(gingival index,GI).3、流行病学研究参考世界卫生组织(WHO)《口腔健康调查基本方法》(第四版)调查方法,采用多阶段、分层、等容量、随机抽样的方法,调查江苏省35-44岁和65-74岁两个年龄组的城乡居民1584人,男女各半,城乡人数各半.结果1、中药复方提取液对各实验细菌均有杀菌作用,对牙周常见可疑致病菌牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌、具核梭杆菌和常见致龋菌变形链球菌的MBC值分别为7.8125、3.90625、7.8125和7.8125 mg/ml.2、中药复方提取液浓度在1*10-7*10-3g/ml,均能明显促进人牙周膜成纤维细胞增殖,与对照组比较,有显著性差异,且1*10-3g/ml作用效应最大.中药复方提取液浓度在1*10-4~1*10-3g/ml,能够明显增加人牙周膜成纤维细胞总蛋白的合成,与对照组比较,有显著性差异.在此范围内,中药复方提取液的作用显示出一个明显的浓度依赖效应和时间依赖效应.3、与对照组比较,用药组细胞的内质网、线粒体等明显增多.4、应用含金银花、紫地丁等组成的含漱液漱口可降低牙周指数,与对照组之间有高度显著差异.5、流行病学调查表明:(1)中老年城乡居民牙周健康的检出率和平均区段数仅为0.70%和0.50;牙龈出血检出率和平均区段数为67.74%和1.78;牙结石检出率和平均区段数为93.93%和4.59;浅牙周袋检出率和平均区段数为32.07%和0.56;深牙周袋检出率和平均区段数为7.46%和0.10.(2)65-74岁年龄组牙周袋检出率和平均区段数高于35-44岁年龄组(P〈0.01).(3)牙周附着丧失记分为2、3、4的检出率和平均区段数均为65-74岁组高于35-44岁组(P〈0.01).结论1、浓度为7.8125mg/ml的中药复方提取液在不破坏牙周局部生态平衡的情况下可有效杀灭牙周细菌.2、中药复方提取液可促进人牙周膜成纤维细胞增殖及蛋白质合成.3、中药复方提取液能促进细胞的代谢和蛋白质的合成,与细胞增殖实验和总蛋白测定结果一致.4、金银花、紫地丁等组成的中药复方漱口液可有效去除牙菌斑,能够发挥药物的抗茵、消炎作用.5、牙周病是口腔常见病、多发病,牙结石是人们口腔卫生面临的一个重要问题.因此,应加强牙周病的预防工作,开展社区口腔卫生服务,提高居民口腔健康水平;并且说明研究开发防治牙周病的药物具有广阔的应用前景.