一株鞘氨醇杆菌合成类胡萝卜素的分子机制和代谢杂环的氧化压力研究
Molecular Mechanism of Carotenoid Synthesis and Oxidative Stress Analysis in the Degradation of Heterocycles by a Sphingobium Yanoikuyae
利用微生物技术去除环境中的有害物质是最为经济可行的环境修复方法.微生物对环境有机污染物的降解主要涉及氧化反应,而有O2参与的氧化反应往往会产生能够损伤DNA、蛋白质和其他细胞组分的活性氧自由基(ROS),影响细胞存活,从而降低微生物对环境有机污染物的降解能力和速率.类胡萝卜素作为一种膜结合的抗氧化剂能够保护细胞抵御氧化压力.本文在课题组前期对一株咔唑降解菌-鞘氨醇杆菌XLDN2-5(Sphingobium yanoikuyae XLDN2-5)进行全基因组测序和注释的基础上,分析预测了6个ORFs涉及类胡萝卜素合成途径,它们分别编码牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPP synthase,CrtE)、八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase, CrtB)、八氢番茄红素脱氢酶(phytoenedehydrogenase, CrtI)、番茄红素环化酶(lycopene cyclase,CrtY)、β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxygenase, CrtZ)和酮酶(β-caroteneketolase,CrtW),将此6个ORF分别命名为crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ和crtW.通过序列比对可知,这些基因与已报道的类胡萝卜素合成相关基因有30-60%的相似性.但与已报道的大多数微生物体内类胡萝卜素合成基因的成簇排布方式不同,在鞘氨醇杆菌XLDN2-5中,除了crtY基因的终止密码子与crtI基因的起始密码子重叠并与crtB基因邻近外,其他类胡萝卜素合成基因散布在基因组的其他位置.随后,利用PCR扩增类胡萝卜素合成相关基因,构建相应质粒,通过双质粒共表达的方法将质粒转入能够积累不同类胡萝卜素中间产物的Escherichia coli中,HPLC、HPLC-MS分析产物,从而验证基因功能.结果表明,crtI基因编码八氢番茄红素脱氢酶,催化八氢番茄红素(phytoene)脱氢生成番茄红素(lycopene);crtY基因编码番茄红素环化酶,在番茄红素的两端环化形成β-胡萝卜素(β-carotene);crtZ基因编码β-胡萝卜素羟化酶,依次在β-胡萝卜素两端环上加一个羟基,经仅在一个环上含有羟基的中间体β-cryptoxanthin,生成玉米黄质(zeaxanthin);而crtE和crtB基因共同表达时却未检测到预期的产物-八氢番茄红素,crtW基因也未显示出β-胡萝卜素酮酶的功能活性,不能将玉米黄质催化生成虾青素(astaxanthin).HPLC-MS分析来自鞘氨醇杆菌XLDN2-5菌体的丙酮抽提物,可确定该菌主要积累玉米黄质.当共代谢咔唑(CA)和二苯并噻吩(DBT)时,菌体颜色从降解CA时的浅黄色变为深黄色,共代谢CA和苯并噻吩(BT)时的菌体颜色次之;菌体中积累的玉米黄质含量随菌体对不同杂环化合物的降解而有极显著的提高(CA CA>BT> DBT),多次添加杂环底物后,菌株XLDN2-5对杂环化合物的降解能力明显减弱.同时,类胡萝卜素合成关键酶-八氢番茄红素脱氢酶基因(crtI)的表达水平随着菌株对不同杂环化合物的降解而增加,且随培养基内DBT浓度的提高而增加.相反,β-胡萝卜素羟化酶基因(crtZ)的表达水平随着菌株对不同种类或不同浓度的杂环化合物的降解而有明显降低,且不随菌体积累玉米黄质含量的变化而变化.八氢番茄红素脱氢酶(CrtI)的高表达能够保证玉米黄质前体-β-胡萝卜素的积累.尽管β-胡萝卜素羟化酶(CrtZ)表达水平降低,但最终会因其反应前体β-胡萝卜素的增加而提高菌体内玉米黄质的含量.总之,在降解杂环化合物的过程中,鞘氨醇杆菌XLDN2-5体内产生的H2O2水平及crtI基因的表达水平与等量菌体内积累的玉米黄质的总量变化趋势一致(CA
- 作者：
- 刘晓瑞
- 学位授予单位：
- 上海交通大学
- 专业名称：
- 微生物学
- 授予学位：
- 博士
- 学位年度：
- 2013年
- 导师姓名：
- 许平
- 中图分类号：
- Q936；X172
- 关键词：
- 鞘氨醇杆菌；杂环化合物的降解；类胡萝卜素；活性氧自由基；氧化压力
- Sphingobium yanoikuyae；Degradation of heterocycles；Carotenoids；Reactive oxygen species (ROS)；Oxidative stress