化疗药物在p53缺陷型肿瘤细胞中对p21启动子激活机制的研究
The Mechanism of p21WAF1/CIP1 Promoter Activation by Chemotherapeutics in p53Negative Cancer Cells

恶性肿瘤,又称癌症,已成为严重危害人类生命健康的疾病之一,全球因癌症而死亡的人数呈逐年上升的趋势.多年来,肿瘤治疗一直是生命科学领域关注的重点.癌症从本质上来说是一种细胞增殖性疾病,因此控制细胞生长,抑制细胞增殖是治疗癌症的有效手段.正常细胞在转化成为癌细胞时,会在细胞生长周期上出现一系列的改变,而这些改变是造成细胞恶性增殖的直接原因.细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinaseinhibitors, CKIs)是对细胞生长周期有重要负调节作用的蛋白因子,主要分为两大类:INK4家族和CIP/KIP家族.而p21WAF1/CIP1(p21)是后者的主要成员之一.作为最早被发现的CKI基因,其生物学作用及调控机制得到了广泛深入的研究.p21主要通过抑制细胞周期蛋白与相应激酶结合形成复合物,从而诱导细胞周期停滞,起到抑制细胞增殖的功能.同时,p21还与细胞分化、衰老、凋亡有重要关系,是细胞外各种生长分化信号作用的靶标,因此在细胞信号传递网络中具有中心节点的作用.大量研究发现,p21是一个潜在的肿瘤抑制基因,但它在生物体内高度保守,很少发生突变.p21在癌细胞中的主要变化是表达量的变化.p21在细胞内的表达水平往往是通过p53依赖型及p53非依赖型两种机制,从转录水平来调控的.许多治疗肿瘤的化学药物能够通过不同的方式上调p21表达,实现抑制肿瘤细胞生长的效果.研究发现,半数以上的人类肿瘤是p53功能缺陷或缺失的,在p53基因突变或缺失的肿瘤细胞中,p21的表达量相对较低,这类细胞中p21转录激活主要是通过p53非依赖型途径实现的.而基因的转录效率与启动子活性直接相关,因此对p21启动子的研究成为关注的重点.我们选取了卵巢癌细胞系SKOV3作为实验对象.该细胞系是p53基因缺陷型细胞,恶性程度较高,且对多种化学药物具有耐受性.为了研究化疗药物抑制肿瘤细胞生长的效果与p21表达量之间的关系,我们构建了p21启动子-荧光素酶报告基因系统,对常用化学药物进行了筛选检测,发现铂类化合物奥沙利铂(oxaliplatin, Oxa)具有明显的激活p21启动子,诱导p21表达,使细胞停滞在S期的作用,而其他化疗药物没有这一效果.说明奥沙利铂对肿瘤细胞的抑制作用与其诱导p21表达具有正相关性.同时在动物水平也证明了奥沙利铂对SKOV3细胞移植肿瘤的抑制效果,而其他化学药物则没有显著作用.为了阐明奥沙利铂是通过启动子上哪种功能元件以及怎样的方式来激活p21启动子的,我们首先对该基因启动子进行了一系列突变,构建了10个不同的突变体.通过启动子-荧光素酶报告基因系统对这些突变体分析检测,将奥沙利铂的应答元件定位在了p21启动子转录起始点上游-216至-236bp之间的碱基序列.同时我们运用生物信息学数据库分析了转录起始点上游-1至-500bp的序列保守性,发现在这500个碱基的DNA片段上,存在一个此前未被报道过的,脊椎动物中序列高度保守的片段,其所在位置是-219至-237bp,恰好与奥沙利铂应答元件的序列重合.说明这一药物应答保守序列在p21启动子的转录调控方面可能具有关键作用.为了研究转录调控机制,我们用电泳迁移率实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)检测了DNA-蛋白质体外结合的情况.针对奥沙利铂应答元件保守序列设计并合成了生物素标记和未标记的寡核苷酸探针,命名F3(wt-213/-242),同时也根据该序列上游相邻位置的DNA序列合成了另外两个寡核苷酸探针F1(-323/-352)和F2(-275/-306),用以和核蛋白提取物孵育反应.这些探针中只有F3能够与细胞核提取物中的蛋白结合,与药物处理与否无关,进一步证实了该区域的重要性.当我们用抗体对蛋白进行鉴定后,确定了该序列是转录因子Sp1/Sp3的结合位点,且Sp1/Sp3所结合的DNA序列恰好形成迴文结构.通过对药物处理前后细胞内Sp1/Sp3蛋白量、细胞定位及蛋白磷酸化修饰的检测,发现药物处理的细胞Sp1/Sp3的蛋白量及胞内定位并没有改变,但是Sp1蛋白的磷酸化明显增多,而且Sp1/Sp3与DNA的结合更加紧密.推测奥沙利铂可能通过磷酸化修饰Sp1,进而改变Sp1/Sp3的结合活性而调控p21启动子.对p21全长启动子的分析结果显示,这一新发现的Sp1/Sp3结合位点与p21启动子上6个经典的Sp1/Sp3结合位点不同,它是唯一的具有高度保守性的元件.最后我们对F3在细胞内的生物学作用进行了初步研究.通过F3片段与p21启动子-荧光素酶报告基因(pFL-Luc)共转染SKOV3,F3与启动子上Sp1/Sp3迴文序列进行竞争.发现在没有药物处理的情况下,转染F3片段能够激活p21启动子,得到与奥沙利铂处理细胞后类似的结果.通过免疫荧光证实p21启动子活化促进了p21蛋白表达.我们推测,在正常情况下,Sp1/Sp3结合在奥沙利铂应答保守元件上,并且募集其他转录抑制因子/辅因子与之结合,形成抑制转录的蛋白复合物,维持p21在正常细胞内的基础表达水平,维持细胞正常生长繁殖,当细胞受到DNA损伤物质刺激时,Sp1磷酸化,该保守元件上的转录抑制因子/辅因子脱落,原有的抑制功能丧失,使得p21启动子活化,从而促进蛋白表达.因此这段序列在奥沙利铂诱导p21的过程中起到了类似"开关"的作用.综上所述,我们首次报道了p21启动子上存在一个高度保守的、能与Sp1/Sp3结合的抑制性功能元件,是维持p21基础表达水平所必需的,并且在奥沙利铂诱导的启动子去抑制调控中具有重要作用.提示我们运用这一保守元件作为筛选诱导p21表达的药物可能是抗肿瘤药物筛选的新策略;而且在选择临床化疗药物和研发抗p53缺陷型肿瘤的新药方面具有应用前景.