棉酚对多浪羊淋巴细胞核酸的影响及多浪羊IFN-γ克隆和表达
The Effects of Gossypol on Lymphocytes Nucleic Acids of Duolang Sheep and Cloning and Expression of IFN-γ from Duolang Sheep
本实验将棉酚作用于体外培养的多浪羊淋巴细胞,采用Trizol法提取棉酚作用于不同时间体外培养淋巴细胞的DNA和总RNA,根据核酸电泳结果,揭示棉酚对淋巴细胞凋亡影响的规律.结果表明:0.071mmol/L的棉酚作用于体外培养的淋巴细胞DNA3h开始降解,4h淋巴细胞DNA出现梯状条带,5h出现完全降解,0.071mol/L的棉酚作用于体外培养的淋巴细胞RNA1h、2h时,28S、18S均出现了涂抹,3h、4h、5h时,18S已降解.以新疆多浪羊淋巴细胞为实验材料,使用Trizol法提取其总RNA,以GenBank中NM001009803的:nRNA序列,用primer premier5.0软件辅助设计了多浪羊IFN-γ的基因,然后以淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR,反转录扩增出IFN-γ的目的基因.将RT-PCR产物切胶回收纯化后连接到pMD-18T克隆载体上转化DH5α,过夜培养,挑选阳性克隆菌,制成30%甘油菌,送北京博大泰克生物基因技术有限责任公司进行DNA序列测定.测序结果表明目的基因的核苷酸大小为582bp,通过多序列比对发现第391位核苷酸发生了突变.IFN-γ基因与pET-28c载体进行连接,酶切鉴定、PCR鉴定后确定,含有目的基因片段的原核表达载体pET-28c-IFN-γ构建成功.然后将重组原核表达载体pET-28c-IFN-γ转化到E.coli BL21中,用IPTG诱导表达,表达出约24.4KDa融合蛋白.同时根据SDS-PAGE显示对融合蛋白进行表达条件的优化,最佳诱导温度是37℃,最佳诱导时间为4.0h,最适IPTG诱导浓度为1.5mmol/L.通过Bandscans.O软件分析融合蛋白的表达量,融合蛋白占菌体总蛋白的14.2%.用融合蛋白pET-28c-IFN-γ免疫家兔,在免疫后45天,Western-blot和琼脂糖扩散试验分析表明,表达的pET-28c-IFN-γ能被家兔的阳性血清所识别,表达蛋白pET-28c-IFN-γ具有较好的反应原性和免疫原性.
- 作者：
- 左文斌
- 学位授予单位：
- 塔里木大学
- 专业名称：
- 生物化学与分子生物学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2012年
- 导师姓名：
- 高庆华
- 中图分类号：
- S826
- 关键词：
- 棉酚；淋巴细胞核酸；IFN-γ克隆；融合表达；抗原性
- Gossypol； Lymphocyte nucleic acid； IFN-γ gene Cloning； Fusion expression； Antigencity
- 基金项目：
- NSFC