新疆卡拉库尔羊TNF-α基因的克隆、原核表达及抗原性分析
Cloning and Prokaryotic Expression of Xinjiang Karakul Sheep TNF-α Gene and the Analysis of Its Antigenicity
细胞因子TNF-α具有复杂的生物学活性,它是由巨噬细胞、单核细胞、多形核白细胞等多种细胞产生.近年来,对TNF基因的基础研究及应用研究已逐渐成为动物抗病育种的重要研究之一本试验以新疆卡拉库尔羊为研究对象,参照GenBank中收录的登录号为NM001024860的绵羊TNF-α基因序列设计一对特异性的引物.利用RT-PCR技术从卡拉库尔羊淋巴细胞总RNA中扩增出TNF-α基因序列,后将TNF-α目的基因与pMD-18T载体相连接,随后再转化到DH5α的感受态细菌中,获得阳性克隆后再将阳性克隆进行PCR及酶切鉴定,序列送交上海生物工程有限公司测序.结果表明:克隆得到的TNF-α序列有1268bp的碱基,包括705bp开放阅读框,编码234个氨基酸.TNF-α序列比较结果显示,与参考序列同源性高达99.86%.TNF结构域较为保守它与牛、海豚、野猪、人的同源性为92.47%、86.99%、87.1%、83.56%.TNF-α含有3个潜在的糖基化位点和12个磷酸化位点,序列中存在71个α螺旋,43个β片层结构区和120个无规则卷曲.TNF-α基因与pET-28b载体进行连接,酶切鉴定、PCR鉴定后确定含有目的基因片段的原核表达载体pET-28b-TNF-α构建成功.然后将重组的原核表达载体pET-28b-TNF-α转化到E.coliBL21中,用IPTG诱导表达,表达出约49KDa融合蛋白.同时根据SDS-PAGE显示对融合蛋白进行表达条件的优化,最佳诱导温度是37℃,最佳诱导时间为4.0h,最佳IPTG诱导浓度为1.0mmol/L.在优化条件后融合蛋白的表达含量通过Bandscan5.0软件分析,占菌体总蛋白的21.6%.pET-28b-TNF-α蛋白可溶性检测,结果显示原核表达质粒pET-28b-TNF-α表达的目的融合蛋白是以可溶的形式存在.用纯化的pET-28b-TNF-α免疫家兔,在免疫后的第45d,Western-blot和琼脂糖扩散试验分析表明,表达的pET-28b-TNF-α能被家兔的阳性血清所识别,表达蛋白pET-28b-TN F-α具有较好的反应原性和免疫原性.
- 作者：
- 贺艳艳
- 学位授予单位：
- 塔里木大学
- 专业名称：
- 生物化学与分子生物学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2012年
- 导师姓名：
- 李莲瑞
- 中图分类号：
- S826
- 关键词：
- TNF-α；基因克隆；融合表达；抗原性
- Tumor necrosis factor alpha； gene cloning； fusion expression； antigencity