南昌霉素和寡霉素次级代谢合成的调控研究
Multiple Pathway-Associated Regulations of Nanchangmycin and Oligomycin
链霉菌是重要的抗生素及其他医畜用药物的产生菌.这些药物主要是伴随着菌体复杂的形态分化、通过严格的次级代谢合成途径产生的.无论是形态变化还是代谢合成,响应菌体内外影响因子的复杂而严密的调控网络都是非常重要的组成部分.本文主要研究与南昌霉素和寡霉素次级代谢合成途径特异性相关的调控因子,并利用调节基因异源互补的方法探索南寡霉素合成基因簇的体内转录激活.南昌霉素生物合成基因簇包含7个可能的调节基因.基因nanR1和nanR2编码的蛋白具有典型SARP的结构域,尤其与结构类似物莫能霉素合成途径的特异性激活因子MonR1同源性非常高.通过RT-PCR实验,南昌霉素转录本组成得到确定.通过对基因簇序列和同源蛋白氨基酸序列的分析,南昌霉素基因簇中5个转录本的启动子区和莫能霉素基因簇中与其中3个同源的基因的启动子区预测出了可能的SARP蛋白结合位点.通过体内基因缺失与回补、突变株中RT-PCR转录分析研究这两个调控基因的功能,揭示出NanR1和NanR2是南昌霉素生物合成的途径特异性转录激活因子.同时增加两个基因的拷贝数,获得了一株南昌霉素高产菌株.突变株中受到转录调控的转录本与带有预测的SARP靶序列启动子的转录本吻合,提示我们生物信息学方法可为次级代谢合成途径的调节研究提供更多的帮助.nanR4基因编码了AraC家族的调节蛋白.中断这个基因,我们获得了另一种南昌霉素的高产菌株,确定了nanR4基因产物抑制南昌霉素合成.通过基因回补恢复nanR4的拷贝数量,增产现象消失.通过转录分析发现,NanR4的失活首先以某种机制使nanR1和nanR2的转录量得到提高,通过这个两个SARP激活因子的级联放大,抗生素合成结构基因的转录量以更大的幅度被提高,最终使南昌霉素高产.南昌霉素基因簇其他的调节基因不受NanR4转录调节.已知的链霉菌抗生素合成途径相关的AraC家族调节蛋白都是转录激活因子,尚未发现抑制抗生素合成的功能,因此我们在南昌霉素合成途径中发现了一个新型的AraC家族转录抑制因子.同时,通过基因中断和突变株产物的高效液相分析,南昌霉素基因簇中其他的调节相关基因对南昌霉素合成的影响并不显著,不是限制产量的关键因素.对南昌霉素生物合成调节基因的功能分析,十分有利于提高南昌霉素的产量,解除限制其产业化生产和大规模使用的瓶颈,丰富了对抗生素生物合成调控的认识,并为菌种的定向遗传改造拓宽了方向.在寡霉素基因簇中有两个编码LAL家族蛋白的基因olmRI和olmRII.对这两个基因分别进行缺失,所得突变株均不能合成寡霉素.在olmRI突变株YQ6中,寡霉素基因簇的PKS基因和后修饰基因的转录水平都明显降低.在olmRII突变株YQ18中,仅寡霉素基因簇右侧的PKS基因和后修饰基因的转录水平明显将低.上述结果显示两个LAL家族蛋白都是依靠结合启动子区域激活寡霉素合成基因转录的正调控因子.在这两个寡霉素不产的突变株中,链霉菌的另一主要产物阿维菌素A2a、A1a两个组分产量提高.南昌链霉菌中有一个与寡霉素生物合成基因簇高度同源的沉默基因簇-南寡霉素基因簇.后者与前者的区别在于缺少了两个LAL家族蛋白中的OlmRI同源蛋白.但是分别将olmRI单基因和olmRI-RII双基因异源互补南昌链霉菌均不能激活南寡霉素基因,进而得到以氨基酸序列预测出的寡霉素类似物.南寡霉素基因簇的沉默不仅是调节基因缺失导致的,还有更复杂的原因.
- 作者：
- 于晴
- 学位授予单位：
- 上海交通大学
- 专业名称：
- 微生物学
- 授予学位：
- 博士
- 学位年度：
- 2012年
- 导师姓名：
- 邓子新
- 中图分类号：
- Q93
- 关键词：
- 链霉菌；次级代谢合成调控；南昌霉素；SARP；AraC；寡霉素；LAL
- Streptomyces； regulation of secordary metabolism； nanchangmycin； SARP； AraC； oligomycin； LAL