未知功能基因c18orf54的克隆表达及初步功能研究

目的:
1.构建c18orf54基因的原核表达质粒,诱导并表达C18orf54重组蛋白,对其进行纯化,制备C18orf54重组蛋白的多克隆抗体.
2.明确C18orf54蛋白在组织及细胞内的表达特征.
3.明确不同浓度的C18orf54重组蛋白对HepG2细胞的影响.
4.明确不同浓度的C18orf54重组蛋白对Jurkat细胞的影响.
5.明确C18orf54基因编码蛋白在肝炎、肝硬化、肝癌患者血清中的表达水平差异.
方法:
1.运用反转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription PCR,RT-PCR)技术,以人的肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞提取的总RNA为模板,合成cDNA,用此cDNA为模板进行体外扩增,得到目的基因c18orf54的全长CDs,克隆至pGEM-T-Easy载体,对其进行双酶切及测序鉴定,正确后将目的基因c18orf54插入原核表达载体pET-32a(+)中,转化入E.coliRL21,并用IPTG诱导表达C18orf54重组蛋白.用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot技术和生物质谱分析证实C18orf54重组蛋白表达正确.大量诱导C18orf54重组蛋白后,利用亲和层析柱法纯化C180rf54重组蛋白.
2.利用纯化后的C18orf54重组蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗C180rf54重组蛋白的多克隆抗体.以纯化后的C18orf54重组蛋白为抗原,用Western blot方法和ELISA技术对多克隆抗体进行特异性分析和效价检测.
3.利用激光共聚焦技术、Western blot技术,以及免疫组织化学技术来观察C18orf54蛋白在组织及细胞内的表达特征.
4.采用不同浓度的C18orf54重组蛋白(O.1,1,10,100,1000ng/ml)和HepG2细胞共同在37℃孵箱中孵育48小时,利用流式细胞仪技术分析,来明确不同浓度的C18orf54重组蛋白对HepG2细胞的可能调控作用.
5.采用不同浓度的C18orf54重组蛋白(0.1,1,10,50,100ng/ml)和Jurkat免疫细胞共同在37℃孵箱中孵育48小时,利用流式细胞仪技术分析,明确不同浓度的C18orf54重组蛋白对Jurkat免疫细胞的影响.
6.采用所制备的C18orf54多克隆抗体包被酶标版,采用ELISA技术,分析C18orf54蛋白在肝炎、肝硬化、肝癌患者血清中的表达水平.
结果:
1.成功构建了c18orf54的原核表达质粒pET-32a(+)-C18orf54,将该质粒转化入EcoliBL2l中,并用IPTG诱导C18orf54重组蛋白的表达,经SDS-PAGE电泳、Western blot及生物质谱分析证实了C18orf54重组蛋白表达正确,对C18orf54重组蛋白进行了大量诱导表达.
2.纯化C18orf54重组蛋白并成功制备了兔抗C18orf54重组蛋白的多克隆抗体.ELISA分析证实该抗体效价>1:1280000,Western blot分析证明该抗体有较好的特异性.
3.利用免疫组织化学技术和Westernblot技术及激光共聚焦技术,证实C18orf54在不同肝脏组织和不同细胞中均有部分表达,在分泌途径中可见该蛋白的GFP融合蛋白部分定位于内质网.
4.利用不同浓度(0.1,1,10,100,1000ng/ml)的C18orf54重组蛋白与HepG2细胞共孵育,用流式细胞仪分析对其细胞周期的影响,发现高浓度C18orf54重组蛋白(>100ng/ml)对HepG2细胞有促进增殖作用.
5.利用不同浓度(0.1,1,10,50,100ng/ml)的C18orf54重组蛋白与Jurkat细胞共孵育,用流式细胞仪分析对其细胞周期的影响,发现C18orf54重组蛋白在该浓度范围内,对Jurkat免疫细胞的细胞周期没有明显作用.
6.ELISA分析结果发现,C18orf54蛋白在肝炎、肝硬化、肝癌患者血清中均可检测到,肝硬化患者显著高于肝癌患者(p=0.0013),但与慢性肝炎患者相比,两组统计学无显性差异(p>0.05).
结论:
1.表达的C180rf54重组蛋白经Western blot技术和生物质谱鉴定正确.
2.免疫实验动物来制备的抗C18orf54重组蛋白的多克隆抗体具有和C18orf54重组蛋白较高的结合活性.
3.免疫组织化学及Western blot结果证实C18orf54在肝炎、肝硬化、肝癌细胞均有表达.
4.高浓度C18orf54重组蛋白(>100ng/ml)体外对HepG2细胞有一定的细胞周期调控作用.
5.在一定的生理浓度范围内(0.1-100ng/ml)C18orf54重组蛋白对Jurkat免疫细胞的增殖没有明显作用.
6.不同人群的C18orf54蛋白ELISA分析表明,肝硬化患者血清中该蛋白水平高于肝癌患者,但与慢性肝炎患者相比,两组无显著性差异.
以上资料提示,C18orf54基因编码的分泌蛋白可能参与了慢性肝病的发病过程.详细的分子生物学机制还有待探讨.