Profilin2及其信号通路在口腔鳞癌中的作用研究
目的:课题前期应用比较蛋白质组学的研究方法,通过构建口腔黏膜上皮细胞癌变模型,已筛选出了45个口腔鳞癌细胞系与口腔永生化正常上皮细胞系之间的潜在差异蛋白质.前期实验结果已经验证了部分癌或抑癌基因对口腔鳞癌细胞生长,增殖及转移的调控作用.此实验旨在通过进一步筛选验证Profilin2在口腔鳞癌的发生发展中的作用,并探讨该家族蛋白及其相关信号通路蛋白的抑癌作用机制.
方法:1.通过分析口腔鳞癌质谱芯片分析结果,筛选出Profilin2基因,并通过RT-PCR,Realtime-PCR,Western blotting实验方法验证该基因:在正常口腔粘膜永生化上皮细胞系及多个不同口腔鳞癌细胞系,口腔正常上皮组织,口腔鳞癌组织中的转录及表达水平的差异.
2.收集88个原发口腔鳞癌患者的鳞癌组织及癌旁正常蜡块(成对),通过分析所有患者的预后相关信息进行分组,进而验证Profilin2的蛋白质表达水平的差异对口腔鳞癌患者预后水平的潜在影响.
3.通过Profilin2的蛋白荧光染色,并同时应用激光共聚焦的定位方法,明确Profilin2在永生化口腔黏膜正常上皮细胞及口腔鳞癌细胞中的亚细胞定位.利用细胞质核蛋白分离技术,进一步验证其细胞定位及差异表达.
4.通过质粒瞬时转染profilin2基因过表达技术,上调:Profilin2基因的蛋白质表达,并研究Profilin2对口腔鳞癌细胞增殖及调亡,细胞活力的影响.
5.通过Realtime PCR,Western blotting的方法,初步验证相关信号通路P27/Cyclin D/CDK与N-WASP/Arp2/3在Profilin2质粒转染后的表达差异,并推测其作用机制.
结果:1.通过二维电泳液相质谱分析,从口腔鳞癌细胞系中筛选出了Profilin1及Profilin2的差异表达蛋白质,通过Hb96,Tca8113,OSC,CAL27,NT等5个不同口腔鳞癌细胞系与永生化正常口腔黏膜上皮细胞系HIOEC比较,并选取32个口腔鳞癌患者的RNA标本,在mRNA转录水平及蛋白表达水平上验证了Profilin2表达下调的芯片实验结果.
2.免疫组化及Realtime-PCR的结果显示:在收集的88对口腔鳞癌组织内,Profilin2的mRNA转录水平及蛋白质表达水平均有较明显下降.将该组患者依照肿瘤部位、大小、血管侵犯、淋巴结转移、临床分期、病理分级等情况进行分组,统计分析后发现Profilin2的表达水平与患者总体生存率显著相关(P<0.001).
3.通过激光共聚焦显微镜的荧光成像方法及核质分离技术,显示Profilin2在口腔鳞癌细胞中的亚细胞定位:细胞核及细胞质.
4.通过构建pQCXIH-Profilin2质粒,并进行瞬时转染、上调Profilin2基因在口腔鳞癌细胞系HB96中的表达.观察该基因上调后,HB96癌细胞出现增殖减缓,细胞活力下降的变化.
5.通过转染pQCXIH-Profilin2质粒,观察72小时后Profiilin2相关蛋白的RNA转录,蛋白表达情况,发现Profilin2对P27的表达无明显调控作用,但对N-WASP/Arp2/3通路的表达有一定相关性.
结论:1.Profilin2在口腔鳞癌细胞系及患者组织中均有较明显下调,而Profilin1在口腔鳞癌与正常口腔粘膜上皮组织中表达基本均为高表达.
2.Profilin2基因在口腔粘膜上皮内的表达产物主要位于细胞核及细胞质内;但在口腔鳞癌细胞中,Profilin2的亚细胞定位发生改变,主要位于细胞核内.此结果意味着Profilin2在鳞癌细胞中的作用方式可能有相应的改变.
3.Profilin2的表达下调,与许多口腔鳞癌患者的总体生存率密切相关,Profilin2可能是一个重要的口腔鳞癌生物预后指标.
4.通过升高Profilin2的表达,抑制了HB96鳞癌细胞的生长,并使鳞癌细胞的运动活力下降,证明Profilin2是一个抑癌基因,是一个潜在的药物靶点.
5.Profilin2对口腔鳞癌细胞的相关抑制作用,可能并不是通过P27/Cyclin D/CDK通路,而是可能是通过N-WASP/Arp2/3信号通路来发挥相关抑癌作用的.
- 作者：
- 马春跃
- 学位授予单位：
- 上海交通大学
- 专业名称：
- 口腔临床医学(口腔颌面外科)
- 授予学位：
- 博士
- 学位年度：
- 2012年
- 导师姓名：
- 张陈平
- 关键词：
- 口腔鳞癌细胞癌；亚细胞定位；Profilin2基因；细胞周期蛋白D激酶；差异表达；信号通路
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